Her beskriver vi en murine xenograft modell som funksjonelt ligner et Ommaya-reservoar hos pasienter. Vi utviklet Murine Ommaya for å studere nye terapeutiske behandlinger for den universelt dødelige leptomeningeal sykdommen.
Leptomeningeal sykdom (LMD) er en uvanlig type sentralnervesystem (CNS) metastase til cerebral spinalvæske (CSF). De vanligste kreftformene som forårsaker LMD er bryst- og lungekreft og melanom. Pasienter diagnostisert med LMD har en svært dårlig prognose og overlever generelt i bare noen få uker eller måneder. En mulig årsak til mangelen på effekt av systemisk terapi mot LMD er unnlatelse av å oppnå terapeutisk effektive konsentrasjoner av stoffet i CSF på grunn av en intakt og relativt ugjennomtrengelig blod-hjerne barriere (BBB) eller blod-CSF barriere over choroid plexus. Derfor kan direkte administrering av legemidler intrathecally eller intraventricularly overvinne disse barrierene. Denne gruppen har utviklet en modell som gjør det mulig for effektiv levering av terapeutiske midler (dvs. legemidler, antistoffer og cellulære terapier) kronisk og gjentatt prøvetaking av CSF for å bestemme legemiddelkonsentrasjoner og målmodulering i CSF (når tumormikromiljøet er målrettet mot mus). Modellen er murinekvivalenten til et magnetisk resonansavbildningskompatibelt Ommaya-reservoar, som brukes klinisk. Denne modellen, som er festet til skallen, har blitt utpekt som “Murine Ommaya.” Som et terapeutisk konseptbevis ble human epidermal vekstfaktorreseptor 2 antistoffer (klone 7.16.4) levert inn i CSF via Murine Ommaya for å behandle mus med LMD fra human epidermal vekstfaktorreseptor 2-positiv brystkreft. Murine Ommaya øker effektiviteten av legemiddellevering ved hjelp av en miniatyr tilgangsport og forhindrer svinn av overflødig stoff; det forstyrrer ikke CSF-prøvetaking for molekylære og immunologiske studier. Murine Ommaya er nyttig for å teste nye terapeutiske behandlinger i eksperimentelle modeller av LMD.
Leptomeningeal sykdom (LMD) er en aggressiv senfasemetastase av CNS, der tumorceller får tilgang til CSF og infiltrerer overflaten av hjernen og ryggmargen1. De vanligste kreftformene som forårsaker LMD inkluderer bryst og lunge samt melanom2. LMD resulterer i en rekke nevrologiske symptomer og tegn som hodepine, kranial nerve pareser, stiv nakke og radikulopatier. Prognosen for pasienter med LMD er generelt svært dårlig (gjennomsnittlig overlevelse måles i uker) og er universelt dødelig3,4,5,6,7. Behandling med kirurgi, stråling og systemisk kjemoterapi er palliativ. Systemisk behandling for LMD kan mislykkes på grunn av utilstrekkelig legemiddelinntrengning i CSF over en intakt BBB- eller blod-CSF-barriere over choroid plexus1.
Derfor kan administrering av kreftterapeutiske behandlinger (f.eks. legemidler og antistoffbaserte behandlinger, inkludert sjekkpunkthemmere og cellulære terapier) direkte inn i CSF, overvinne denne begrensningen8. Tilgang til og prøvetaking av CSF fra pasienter er mulig gjennom et Ommaya-reservoar som er implantert under hodebunnen. Denne enheten tillater administrering av kreftmidler (f.eks. metotreksat og trastuzumab) samt prøvetaking av CSF for diagnostiske studier (f.eks. cytologiske diagnosen LMD for å overvåke for respons på behandling) uten å utføre en spinalkran. Et murine Ommaya reservoar ble designet for å etterligne de som brukes klinisk. Reservoaret krever montering av en tilgangsport og avstandsdeler og en modifikasjon av musens kannkulasjonsteknikk, noe som gjør at enheten kan forbli permanent intakt gjennom hele narkotikastudien. Denne enheten er utpekt som “Murine Ommaya”.
I motsetning til den osmotiske infusjonspumpeteknikken, som krever forberedelse av overflødige væskevolumer for å forhåndsfylle det tomme rommet i slangen og kontinuerlig infusjon over hyppige injeksjoner9, minimerer Murine Ommaya svinningen av legemiddelløsninger. Det tillater effektiv administrering av flere enkeltdoser av behandlinger til enhver tid i små mengder (3-7 μL) i CSF ved hjelp av en Hamilton-sprøyte, en miniatyr tilgangsport og en automatisk injektor. I sanntid kan effekten av testmedisiner mot LMD bestemmes ved avbildning. Ved hjelp av denne tilnærmingen kan en rekke kjemoterapier, antistoffer og celleimmunoterapier (som enkelt- eller kombinerte midler) testes mot LMD for å oversette in vivo-funn til rasjonelle behandlingsstrategier for pasienter. For ytterligere å forbedre bildekapasiteten for en pasientavledet xenograft (PDX) modell av LMD, ble det inngått et samarbeid med en produsent for å utvikle en MAGNETISK RESONANSavbildning (MR) kompatibel versjon av Murine Ommaya, som ikke krever montering og er klar til bruk. MR-kapasitet er gunstig, spesielt for PDX-modeller der mengden sirkulerende tumorceller (CTCer) fra CSF noen ganger er den begrensende faktoren, og ofte når prelabeling CTCs er umulig.
Dette dokumentet beskriver en detaljert protokoll som begynner med injeksjon av CTCer for å gjengi mus med LMD . Murine Ommaya blir deretter kirurgisk implantert, og flere behandlingstrinn via Murine Ommaya utføres. Som et konseptbevis for demonstrasjon ble det utført en in vivo side-by-side sammenligning, der murin menneskelig epidermal vekstfaktorreseptor 2 (Her2) antistoff kalt klone 7.16.4 (den menneskelige ekvivalenten til trastuzumab) ble levert10. Antistoffet retter seg mot Her2+ brystkreftceller enten via Murine Ommaya (direkte målrettet eller intratekal terapi) eller ved intraperitoneal injeksjon (systemisk terapi). Resultatene viste at mus med LMD som fikk direkte intratekal immunterapi levde betydelig lenger enn de som ble behandlet med samme terapi systemisk. CNS-metastasene hos mus behandlet via Murine Ommaya ble nesten fullstendig regressert av den tredje dosen av den tredje behandlingsuken, noe som resulterte i forbedret total overlevelse.
Her har Murine Ommaya blitt beskrevet som en pålitelig modell, som gjør det mulig å gjentatt administrering av kreftmidler i CSF-rommet i prekliniske modeller av LMD og andre CNS-relaterte sykdommer. CSF ble samplet fra mus mens enheten fortsatt var festet uten avbrudd. Denne direkte målrettede terapi xenograft-modellen er et viktig skritt i å utvikle og teste rasjonelle behandlingsstrategier for LMD. Tiden fra cisterna magna injeksjoner til det første tegn på LMD utvikling varierer avhengig av kreftcelle type. LMD- og CNS-metastaser begynner å ta form rundt 1 eller 2 uker etter CTC-inokulering. Hvis en svært proliferativ kreftcellelinje brukes, er det mulig at metastase kan forekomme om <7 dager. I dette tilfellet kan vaskularisering på grunn av tumorvekst noen ganger gjøre implantasjon av Murine Ommaya utfordrende. En løsning på denne utfordringen er å redusere antall kreftceller til injeksjon i CSF-rommet, noe som gir mer tid før tumorutvikling. Videre har denne protokollen blitt optimalisert for å implantere Murine Ommaya senest 72 timer etter cisterna magna injeksjonen for å sikre nok tid for mus til å komme seg etter operasjonen før den første behandlingen. Forskeren bør beregne vekstraten for CTCene i xenograftmodeller før de planlegger behandlingsregimet.
Selv om det finnes andre direkte intraventrikulære leveringsmetoder, for eksempel bruk av et osmotisk pumpesystem eller en intracerebroventricular (ICV) bolusinjeksjon, som beskrevet tidligere9, er det flere fordeler med å bruke Murine Ommaya-modellen. For eksempel gjøres en ICV bolusinjeksjon i en enkelt levering, mens Murine Ommaya tillater flere doser behandling når som helst, enten gitt som et enkelt middel eller som kombinerte terapier. Den osmotiske pumpen er designet for å opprettholde i opptil 14, 28 eller 42 dager før pumpen må byttes ut, og noen ganger oftere hvis en mindre mus med en mindre pumpe brukes. Endring av osmotisk pumpe krever en kirurgisk prosedyre, noe som gir stress til tumorbærende mus. En Murine Ommaya-erstatning er ikke nødvendig for langvarige eksperimenter så lenge enheten forblir intakt. Det minimerer også potensiell variasjon som skyldes endring av pumpen9. Implanterte Murine Ommayas i eksperimentelle mus forble intakt i mer enn 42 dager, og denne varigheten tillot langvarige behandlingsregimer.
Tidligere funn tyder på at en pulsatile periodisk dosering i CSF har bedre effekt mot LMD enn en langvarig legemiddelleveringsprosess ved infusjon13. Det ville være umulig å utføre gjentatte endoseinjeksjoner ved hjelp av det osmotiske pumpesystemet. Det er ingen enkel måte å skylle ut den gjenværende fanget væsken etter hver injeksjon. Den osmotiske pumpen er også begrenset til å levere blandinger av kompatible eller enkle legemidler og krever vanligvis høyere mengder legemiddelforberedelse for kontinuerlig infusjon. Derimot er Murine Ommaya designet for nøyaktige mikroinjeksjoner så lite som 3 til 7 μL, uten å måtte ta hensyn til død plass, og det er ingen begrensning på hvilken type medikamenter forskere kan bruke, inkludert immuncelleterapi. Murine Ommaya minimerer også reagensavfall hvis en bestemt prøve er dyrebar og maksimerer bruken av den ressursen. For ethvert behandlingsregime som krever flere doser anti-kreftbehandlinger, er Murine Ommaya enkel å bruke, og det er minimal risiko for infeksjon eller kirurgisk feiloppfinnelse, med de alternative tilnærmingene til gjentatte ganger tilgang til CSF kirurgisk eller via gjentatt levering med en nål. Murine Ommaya gir forskere fleksibilitet til å justere legemiddelkonsentrasjoner og doseringsfrekvenser og vurdere målmodulering og varighet av studien i henhold til forskningen av interesse.
En begrensning av Murine Ommaya er at forskere kan finne det vanskelig å implantere enheten i mindre mus. Derfor er det bedre å bruke mus som er minst 8 til 10 uker. Det er mulig for Murine Ommaya å komme av under behandlingsstudien hvis enheten ikke er festet til skallen under implantasjonstrinnene og limet slites av, eller hvis musene har tuklet med den. Sistnevnte scenario oppstår oftere når flere mus ble plassert i samme bur. Derfor anbefales det å huse ikke mer enn to Murine Ommaya-implanterte mus per bur i løpet av behandlingsplanen. Denne protokollen ble modifisert for å påføre cyanokrylat sterilt lim på avstandsstykket, som ble funnet å være det mest effektive limet for å feste avstandsstykken til skalleoverflaten og forhindre at Murine Ommaya kom av. Resultatene viste at LMD-mus hadde nytte av direkte intratekal terapi via Murine Ommaya, med økt total overlevelse. Enkelt mikrolitervolumer kan trygt administreres, omgå BBB, og dermed redusere mengden legemiddelforberedelse. Viktigst av alt, musene som ble kurert av CNS-metastaser fra Her2-antistoff immunterapistudien har forblitt sunne.
Et samarbeid med en produsent hadde som mål å utvikle en MR-kompatibel versjon av Murine Ommaya for PDX-modellen til LMD. Fordi denne prototypeversjonen har en spacer innlemmet, er det ikke nødvendig med montering, noe som gir bedre overholdelse av skallen. En begrensning av denne prototypen er at selv om enheten er MR-kompatibel, genererer den en skygge der enheten settes inn, noe som reduserer synligheten til bildet for kvantifiseringsanalyser. Den MR-kompatible versjonen er et godt alternativt verktøy når ex vivo CTC-prøvetaking er en begrensende faktor, og prelabeling av celler er ikke mulig. Kombinasjonen av en LMD xenograft modell og Murine Ommaya-teknikken er gunstig for å studere direkte målrettet legemiddeleffekt som omgår BBB. Resultatene fra disse in vivo-studiene er klinisk relevante for å designe rasjonelle terapeutiske strategier for pasienter med LMD.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil takke Michele L. Danielson, Tricia Favors-Watson og resten av Comparative Medicine-teamet ved University of South Florida for deres tekniske støtte og vedlikehold av dyrene våre. Vi takker Instech Laboratories, Inc. for deres innsats i samarbeid med oss basert på vår forespørsel om å utvikle en MR-kompatibel Murine Ommaya. Dette arbeidet støttes av National Institutes of Health (NIH) R21 CA216756 (til K.S.M. Smalley), Department of Defense (DOD) W81XWH1910675 (til B. Czerniecki og P. Kalinski), og Moffitt Cancer Center CBMM Innovative Awards (til P. Forsyth og D. Duckett). Redaksjonell bistand ble gitt av Moffitt Cancer Centers Office of Scientific Writing av Dr. Paul Fletcher og Daley Drucker. Det ble ikke gitt noen kompensasjon utover deres vanlige lønn.
1 mm spacer disc | Alzet, Durect Corporation | #0008670 | Spacer disc only |
4-0 ethilon nylon suture | Any vendor | n/a | |
Automatic syringe pumps | Harvard Syringe Pumps (or any vendor) | #70-4505 | Pump 11 Elite |
Bead sterilizer | Braintree Scientific Inc. (or any vendor) | #GER 5287-120V | Germinator 500 |
Buprenorphine Sustained-Release (Bup-SR) | Zoopharm | DEA controlled | |
Cyanoacrylate sterile adhesive | Any vendor | ||
Gas inhalation anestehsia system | VeteEquip | #901812 | COMPAC5 |
Hamilton microliter syringes | Hamilton | 10, 25, 50, and 100 μL | 30 G for cisterna magna injection |
Hydrogen peroxide | Any vendor | n/a | |
IVIS 200 imaging system | Caliper Life Sciences | n/a | |
Magnifying glass with light | Any vendor | n/a | |
Microdrill | Stoelting (or any vendor) | #51555M | |
MRI imaging | Bruker | BioSpec series | Optional |
Murine Ommaya (MRI-compatible) prototype | Instech Laboratories, Inc. | #VAB620-25MRI-3.3 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Any vendor | n/a | 0.1 mm Sterile-Filtered |
PinPort injector | Instech Laboratories, Inc. | #PNP3M-50 | |
PinPort | Instech Laboratories, Inc. | #1-PNP3F28-50 | |
Rodent Surgical Instruments (Scissors, Forceps) | Roboz Surgical Instrument (or any vendor) | ||
Stereotaxic device | Stoelting (or any vendor) | #51730M | |
Sterile blue paper/ drape covering | Any vendor | n/a | n/a |
Sterile cotton sticks | Any vendor | n/a |