Aqui, descrevemos um modelo de xenoenxerto de murina que se assemelha funcionalmente a um reservatório de Ommaya em pacientes. Desenvolvemos a Murine Ommaya para estudar novas terapêuticas para a doença leptomeningeal universalmente fatal.
A doença leptomeningeal (LMD) é um tipo incomum de metástase do sistema nervoso central (SNC) ao fluido espinhal cerebral (CSF). Os cânceres mais comuns que causam LMD são cânceres de mama e pulmão e melanoma. Pacientes diagnosticados com LMD têm um prognóstico muito ruim e geralmente sobrevivem por apenas algumas semanas ou meses. Uma possível razão para a falta de eficácia da terapia sistêmica contra lMD é a falha em alcançar concentrações terapêuticamente eficazes de droga no CSF devido a uma barreira hematoencefálica intacta e relativamente impermeável (BBB) ou barreira sanguínea-CSF através do plexo coroide. Portanto, administrar diretamente drogas intratecally ou intraventricularmente pode superar essas barreiras. Esse grupo desenvolveu um modelo que permite a entrega efetiva de terapêuticas (ou seja, drogas, anticorpos e terapias celulares) cronicamente e a amostragem repetida de CSF para determinar concentrações de medicamentos e modulação de alvo no CSF (quando o microambiente tumoral é direcionado em camundongos). O modelo é o equivalente murino de um reservatório Ommaya compatível com ressonância magnética, que é usado clinicamente. Este modelo, que é afixado no crânio, foi designado como o “Murine Ommaya”. Como prova terapêutica de conceito, o receptor do fator de crescimento epidérmico humano 2 anticorpos (clone 7.16.4) foram entregues no CSF através do Murine Ommaya para tratar camundongos com LMD do receptor de fator de crescimento epidérmico humano 2-positivo câncer de mama. O Murine Ommaya aumenta a eficiência da entrega de medicamentos usando um porto de acesso em miniatura e previne o desperdício de excesso de droga; não interfere na amostragem de CSF para estudos moleculares e imunológicos. O Murine Ommaya é útil para testar novas terapêuticas em modelos experimentais de LMD.
A doença leptomeningeal (LMD) é uma metástase agressiva em estágio avançado do SNC, na qual as células tumorais acessam o CSF e se infiltram na superfície do cérebro e da medulaespinhal 1. Os cânceres mais comuns que causam LMD incluem os da mama e do pulmão, bem como o melanoma2. A LMD resulta em uma série de sintomas neurológicos e sinais como dores de cabeça, paralisias nervosas cranianas, pescoço duro e radiculopatias. O prognóstico para pacientes com LMD é geralmente muito ruim (a sobrevida média é medida em semanas) e é universalmente fatal3,4,5,6,7. O tratamento com cirurgia, radiação e quimioterapia sistêmica é paliativo. A terapia sistêmica para LMD pode falhar devido à penetração inadequada de drogas no CSF através de uma barreira BBB intacta ou sangue-CSF através do plexo coroide1.
Portanto, a administração terapêutica do câncer (por exemplo, medicamentos e tratamentos à base de anticorpos, incluindo inibidores de checkpoint e terapias celulares) diretamente no CSF pode superar essa limitação8. O acesso e amostragem de CSF de pacientes é possível através de um reservatório de Ommaya que é implantado sob o couro cabeludo. Este dispositivo permite a administração de agentes oncológicos (por exemplo, metotrexato e trastuzumab) bem como a amostragem de CSF para estudos diagnósticos (por exemplo, o diagnóstico citológico da LMD para monitorar as respostas ao tratamento) sem realizar uma punção espinhal. Um reservatório de Murine Ommaya foi projetado para imitar aqueles usados clinicamente. O reservatório requer a montagem de uma porta de acesso e partes espaçadoras e uma modificação da técnica de cannulação do rato, que permite que o dispositivo permaneça permanentemente intacto durante toda a duração do estudo da droga. Este dispositivo foi designado como o “Murine Ommaya”.
Em contraste com a técnica da bomba de infusão osmótica, que requer a preparação de volumes líquidos excedentes para pré-encher o espaço vazio na tubulação e infusão contínua sobre injeções frequentes9, o Murine Ommaya minimiza o desperdício de soluções medicamentosas. Permite a administração efetiva de múltiplas doses únicas de tratamentos a qualquer momento em pequenas quantidades (3-7 μL) no CSF usando uma seringa Hamilton, uma porta de acesso em miniatura e um injetor automático. Em tempo real, a eficácia dos medicamentos de teste contra LMD pode ser determinada por imagem. Usando essa abordagem, uma variedade de quimoterapias, anticorpos e imunoterápicos celulares (como agentes únicos ou combinados) pode ser testada contra LMD para traduzir achados in vivo em estratégias de tratamento racional para os pacientes. Para melhorar ainda mais a capacidade de imagem de um modelo de Xenerx (PDX) derivado do paciente ( PDX), uma colaboração foi realizada com um fabricante para desenvolver uma versão compatível com ressonância magnética (MRI) do Murine Ommaya, que não requer montagem e está pronta para uso. A capacidade de ressonância magnética é benéfica, especialmente para modelos de PDX em que a quantidade de células tumorais circulantes (CTCs) de CSF é às vezes o fator limitante, e muitas vezes quando os CTCs pré-rotulantes são inviáveis.
Este artigo descreve um protocolo detalhado que começa com a injeção de CTCs para renderizar camundongos com LMD . O Murine Ommaya é então implantado cirurgicamente, e várias etapas de tratamento medicamentoso através do Murine Ommaya são realizadas. Como prova de conceito para demonstração, foi realizada uma comparação in vivo lado a lado, na qual foi entregue o anticorpo 2 (Her2) do fator de crescimento humano murino chamado clone 7.16.4 (o equivalente humano de trastuzumab)10. O anticorpo tem como alvo as células cancerígenas de mama Her2+ através da Murine Ommaya (terapia direta ou intratecal) ou por injeção intraperitoneal (terapia sistêmica). Os resultados mostraram que camundongos com LMD que receberam imunoterapia intratecal direta viveram significativamente mais tempo do que aqueles tratados com a mesma terapia sistematicamente. As metástases cns em camundongos tratados através do Murine Ommaya foram quase completamente regredidas pela terceira dose da terceira semana de tratamento, resultando em melhor sobrevida geral.
Aqui, o Murine Ommaya foi descrito como um modelo confiável, que permite a administração repetida de agentes anticâncer no espaço CSF em modelos pré-clínicos de LMD e outras doenças relacionadas ao CNS. CSF foi amostrado de camundongos enquanto o dispositivo ainda estava conectado sem interrupção. Este modelo de xenoenxerto de terapia direcionada é um passo importante no desenvolvimento e teste de estratégias de tratamento racional para LMD. O tempo desde as injeções de cisterna magna até o sinal inicial do desenvolvimento de LMD varia dependendo do tipo de célula cancerígena. Metástases LMD e CNS começam a tomar forma cerca de 1 ou 2 semanas após a inoculação do CTC. Se uma linha de células cancerígenas altamente proliferativa for usada, é possível que a metástase possa ocorrer em <7 dias. Neste caso, a vascularização devido ao crescimento do tumor pode, por vezes, tornar a implantação do Murine Ommaya desafiadora. Uma solução para este desafio é reduzir o número de células cancerígenas para injeção no espaço CSF, permitindo mais tempo antes do desenvolvimento do tumor. Além disso, este protocolo foi otimizado para implantar o Murine Ommaya no máximo 72 h após a injeção cisterna magna para garantir tempo suficiente para os camundongos se recuperarem da cirurgia antes do primeiro tratamento. Os pesquisadores devem calcular a taxa de crescimento dos CTCs em modelos de xenoenxerto antes de planejar o regime de tratamento.
Embora existam outros métodos de entrega intraventricular direto, como o uso de um sistema de bomba osmótica ou uma injeção de bolus intracerebroventricular (ICV), como descrito anteriormente9, existem várias vantagens em usar o modelo Murine Ommaya. Por exemplo, uma injeção de bolus ICV é feita em uma única entrega, enquanto a Murine Ommaya permite múltiplas doses de tratamento a qualquer momento, seja dada como um único agente ou como terapias combinadas. A bomba osmótica foi projetada para sustentar por até 14, 28 ou 42 dias antes que a bomba precise ser reposição, e às vezes com mais frequência se um rato menor com uma bomba menor for usado. Mudar a bomba osmótica requer um procedimento cirúrgico, que adiciona estresse aos camundongos portadores de tumor. Uma substituição murine ommaya não é necessária para experimentos de longa duração, desde que o dispositivo permaneça intacto. Também minimiza a variabilidade potencial que resulta da alteração da bomba9. Murine Ommayas implantada nos camundongos experimentais permaneceu intacta por mais de 42 dias, e essa duração permitiu regimes de tratamento de longa duração.
Achados anteriores sugerem que uma dosagem intermitente pulsante no CSF tem melhor eficácia contra a LMD do que um processo prolongado de entrega de medicamentos por infusão13. Seria impossível realizar repetidas injeções de dose única usando o sistema de bomba osmótica. Não há uma maneira fácil de limpar o líquido preso restante após cada injeção. A bomba osmótica também se limita a fornecer misturas de drogas compatíveis ou únicas e normalmente requer maiores volumes de preparação de medicamentos para infusão contínua. Em contraste, o Murine Ommaya foi projetado para microinjeções precisas de apenas 3 a 7 μL, sem ter que explicar o espaço morto, e não há limitação sobre o tipo de drogas que os pesquisadores podem usar, incluindo a terapia de células imunes. O Murine Ommaya também minimiza o desperdício de reagentes se uma determinada amostra for preciosa e maximizar o uso desse recurso. Para qualquer regime de tratamento que exija múltiplas doses de terapias anticâncer, o Murine Ommaya é fácil de usar, e há um risco mínimo de infecção ou desventura cirúrgica, com as abordagens alternativas de acessar repetidamente o CSF cirurgicamente ou através de parto repetido com uma agulha. O Murine Ommaya fornece aos pesquisadores a flexibilidade para ajustar concentrações de medicamentos e frequências de dosagem e avaliar a modulação e duração do objetivo do estudo de acordo com a pesquisa de interesse.
Uma limitação do Murine Ommaya é que os pesquisadores podem achar difícil implantar o dispositivo em camundongos menores. Portanto, é melhor usar camundongos com pelo menos 8 a 10 semanas de idade. É possível que a Murine Ommaya saia durante o teste de tratamento se o dispositivo não estiver preso ao crânio durante as etapas de implantação e a cola passar, ou se os ratos tiverem adulterado abrasivamente. Este último cenário ocorre com mais frequência quando vários camundongos foram alojados na mesma gaiola. Assim, recomenda-se abrigar não mais do que dois camundongos implantados por gaiola murine ommaya durante a duração do cronograma de tratamento. Este protocolo foi modificado para aplicar o adesivo estéril cianoacrilato no espaçador, que foi encontrado como a cola mais eficaz para aderir o espaçador à superfície do crânio e impedir que o Murine Ommaya saia. Os resultados mostraram que os camundongos com LMD se beneficiaram da terapia intratecal direta através do Murine Ommaya, com maior sobrevida geral. Volumes de microliter únicos poderiam ser administrados com segurança, contornando o BBB, reduzindo assim a quantidade de preparação de medicamentos. Mais importante, os camundongos que foram curados de metástases CNS do estudo de imunoterapia de anticorpos Her2 permaneceram saudáveis.
Uma colaboração com um fabricante teve como objetivo desenvolver uma versão compatível com ressonância magnética do Murine Ommaya para o modelo PDX de LMD. Como esta versão protótipo tem um espaçador incorporado, nenhum conjunto é necessário, permitindo uma melhor adesão ao crânio. Uma limitação deste protótipo é que, embora o dispositivo seja compatível com ressonância magnética, ele gera uma sombra onde o dispositivo está inserido, o que diminui a visibilidade da imagem para análises de quantificação. A versão compatível com ressonância magnética é uma boa ferramenta alternativa quando a amostragem ex vivo CTC é um fator limitante, e células de pré-rotulagem não são viáveis. A combinação de um modelo de xenoenxerto LMD e a técnica Murine Ommaya é benéfica para estudar a eficácia da droga direta contornando o BBB. Os resultados desses estudos in vivo são clinicamente relevantes para a concepção de estratégias terapêuticas racionais para pacientes com LMD.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer a Michele L. Danielson, Tricia Favors-Watson, e ao resto da equipe de Medicina Comparada da Universidade do Sul da Flórida por seu apoio técnico e manutenção de nossos animais. Agradecemos à Instech Laboratories, Inc. por seu esforço trabalhando conosco com base em nosso pedido para desenvolver uma Murine Ommaya compatível com ressonância magnética. Este trabalho é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) R21 CA216756 (para K.S.M. Smalley), Departamento de Defesa (DOD) W81XWH1910675 (para B. Czerniecki e P. Kalinski), e pelo Moffitt Cancer Center CBMM Innovative Awards (para P. Forsyth e D. Duckett). A assistência editorial foi prestada pelo Escritório de Escrita Científica do Moffitt Cancer Center pelo Dr. Paul Fletcher e Daley Drucker. Nenhuma compensação foi dada além de seus salários regulares.
1 mm spacer disc | Alzet, Durect Corporation | #0008670 | Spacer disc only |
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