Här beskriver vi en murin xenograft modell som funktionellt liknar en Ommaya reservoar hos patienter. Vi utvecklade Murine Ommaya för att studera nya terapier för den universellt dödliga leptomeningeal sjukdomen.
Leptomeningeal sjukdom (LMD) är en ovanlig typ av centrala nervsystemet (CNS) metastasering till cerebral spinal vätska (CSF). De vanligaste cancerformerna som orsakar LMD är bröst- och lungcancer och melanom. Patienter som diagnostiserats med LMD har en mycket dålig prognos och överlever i allmänhet bara i några veckor eller månader. En möjlig orsak till bristen på effekt av systemisk terapi mot LMD är misslyckandet med att uppnå terapeutiskt effektiva koncentrationer av läkemedel i CSF på grund av en intakt och relativt ogenomtränglig blod- hjärnbarriär (BBB) eller blod-CSF-barriär över choroidplexus. Därför, direkt administrera läkemedel intratekalt eller intraventricularly kan övervinna dessa hinder. Denna grupp har utvecklat en modell som möjliggör effektiv leverans av terapier (dvs. läkemedel, antikroppar och cellulära terapier) kroniskt och upprepad provtagning av CSF för att bestämma läkemedelskoncentrationer och målmodulering i CSF (när tumörmikromiljön är riktad mot möss). Modellen är murin motsvarigheten till en magnetisk resonanstomografi-kompatibel Ommaya reservoar, som används kliniskt. Denna modell, som är fäst vid skallen, har utsetts till “Murine Ommaya”. Som ett terapeutiskt konceptbevis levererades human epidermal tillväxtfaktorreceptor 2 antikroppar (klon 7.16.4) till CSF via Murine Ommaya för att behandla möss med LMD från human epidermal tillväxtfaktorreceptor 2-positiv bröstcancer. Murine Ommaya ökar effektiviteten av läkemedelsleverans med hjälp av en miniatyråtkomstport och förhindrar slöseri med överskott av läkemedel; det stör inte CSF-provtagning för molekylära och immunologiska studier. Murine Ommaya är användbar för att testa nya terapier i experimentella modeller av LMD.
Leptomeningeal sjukdom (LMD) är en aggressiv sena metastasering av CNS, där tumörceller kommer åt CSF och infiltrerar ytan av hjärnan ochryggmärgen 1. De vanligaste cancerformerna som orsakar LMD inkluderar bröst och lunga samt melanom2. LMD resulterar i ett antal neurologiska symtom och tecken såsom huvudvärk, hjärnskålen nerv palsies, stel nacke och radiculopathies. Prognosen för patienter med LMD är i allmänhet mycket dålig (genomsnittlig överlevnad mäts i veckor) och är universellt dödlig3,4,5,6,7. Behandling med kirurgi, strålning och systemisk kemoterapi är palliativ. Systemisk terapi för LMD kan misslyckas på grund av otillräcklig läkemedelspenetration i CSF över en intakt BBB- eller blod-CSF-barriär över choroidplexus1.
Att administrera cancerterapier (t.ex. läkemedel och antikroppsbaserade behandlingar inklusive kontrollpunktshämmare och cellterapier) direkt i CSF kan därför övervinna dennabegränsning 8. Tillgång till och provtagning av CSF från patienter är möjlig genom en Ommaya-reservoar som implanteras under hårbotten. Denna apparat möjliggör administrering av cancermedel (t.ex. metotrexat och trastuzumab) samt provtagning av CSF för diagnostiska studier (t.ex. cytologisk diagnos av LMD för att övervaka för behandlingssvar) utan att utföra en spinalkran. En murin Ommaya reservoar utformades för att efterlikna de som används kliniskt. Behållaren kräver montering av en åtkomstport och distansdelar och en modifiering av musens kannuleringsteknik, vilket gör att enheten kan förbli permanent intakt under hela läkemedelsstudiens varaktighet. Denna enhet har utsetts till “Murine Ommaya”.
I motsats till den osmotiska infusionspumptekniken, som kräver beredning av överskott av vätskevolymer för att fylla det tomma utrymmet i slangen och kontinuerlig infusion över frekventainjektioner 9, minimerar Murine Ommaya slöseriet med läkemedelslösningar. Det möjliggör effektiv administrering av flera enstaka doser av behandlingar vid en given tidpunkt i små mängder (3-7 μL) till CSF med hjälp av en Hamilton-spruta, en miniatyråtkomstport och en automatisk injektor. I realtid kan effekten av testläkemedel mot LMD bestämmas genom avbildning. Med hjälp av detta tillvägagångssätt kan en mängd olika kemoterapier, antikroppar och cellimmunterapier (som enstaka eller kombinerade medel) testas mot LMD för att översätta in vivo-fynd till rationella behandlingsstrategier för patienter. För att ytterligare förbättra bildframställningskapaciteten för en patientledd xenograftmodell (PDX) av LMD, genomfördes ett samarbete med en tillverkare för att utveckla en magnetisk resonanstomografi (MRT)-kompatibel version av Murine Ommaya, som inte kräver någon montering och är klar att användas. MRI-kapacitet är fördelaktigt, särskilt för PDX-modeller där mängden cirkulerande tumörceller (CTC) från CSF ibland är den begränsande faktorn, och ofta när prelabeling CTCs är ogenomförbar.
Detta dokument beskriver ett detaljerat protokoll som börjar med injektion av CTC för att göra möss med LMD . Murine Ommaya implanteras sedan kirurgiskt, och flera läkemedelsbehandlingssteg via Murine Ommaya utförs. Som ett konceptbevis för demonstration utfördes en in vivo sida vid sida jämförelse, där murin mänskliga epidermal tillväxtfaktor receptor 2 (Her2) antikroppar kallas klon 7.16.4 (den mänskliga motsvarigheten till trastuzumab) levererades10. Antikroppen riktar sig till Her2+ bröstcancerceller antingen via Murine Ommaya (direkt eller intratekal behandling) eller genom intraperitoneal injektion (systemisk terapi). Resultaten visade att möss med LMD som fick direkt intratekal immunterapi levde betydligt längre än de som behandlades med samma behandling systemiskt. CNS-metastaserna hos möss som behandlades via Murine Ommaya återgått nästan helt av den tredje dosen av den tredje behandlingsveckan, vilket resulterade i förbättrad total överlevnad.
Här har Murine Ommaya beskrivits som en pålitlig modell, vilket möjliggör upprepad administrering av cancermedel till CSF-utrymmet i prekliniska modeller av LMD och andra CNS-relaterade sjukdomar. CSF provtogs från möss medan enheten fortfarande var fastsatt utan avbrott. Denna direktriktade terapi xenograft modell är ett viktigt steg i att utveckla och testa rationella behandlingsstrategier för LMD. Tiden från cisterna magna injektioner till det första tecknet på LMD utveckling varierar beroende på cancercellstyp. LMD- och CNS-metastaser börjar bildas cirka 1 eller 2 veckor efter CTC-inokulering. Om en mycket proliferativ cancercelllinje används är det möjligt att metastasering kan uppstå på <7 dagar. I det här fallet kan vaskularisering på grund av tumörtillväxt ibland göra implantation av Murine Ommaya utmanande. En lösning på denna utmaning är att minska antalet cancerceller för injektion i CSF-utrymmet, vilket ger mer tid före tumörutveckling. Dessutom har detta protokoll optimerats för att implantera Murine Ommaya senast 72 timmar efter cisterna magna injektionen för att säkerställa tillräckligt med tid för möss att återhämta sig från kirurgi före den första behandlingen. Forskare bör beräkna tillväxttakten för CTC i xenograftmodeller innan behandlingsregimen planeras.
Även om det finns andra direkta intraventricular leveransmetoder, såsom att använda ett osmotic pumpsystem eller en intratracerebroventricular (ICV) bolus injektion, som beskrivitstidigare 9, det finns flera fördelar med att använda Murine Ommaya modell. Till exempel görs en ICV bolus injektion i en enda leverans, medan Murine Ommaya tillåter flera doser av behandling när som helst, oavsett om det ges som ett enda medel eller som kombinerade terapier. Den osmotiska pumpen är utformad för att hålla i upp till 14, 28 eller 42 dagar innan pumpen behöver bytas ut, och ibland oftare om en mindre mus med en mindre pump används. Att byta osmotisk pump kräver ett kirurgiskt ingrepp, vilket ökar stressen hos tumörbärande möss. En Murine Ommaya ersättning är inte nödvändig för långvariga experiment så länge enheten förblir intakt. Det minimerar också potentiell variabilitet som är resultatet av att byta pump9. Implanterade Murine Ommayas i de experimentella mössen förblev intakta längre än 42 dagar, och denna varaktighet tillät långlivade behandlingsregimer.
Tidigare resultat tyder på att en pulsatil intermittent dosering i CSF har bättre effekt mot LMD än en långvarig drug delivery process genom infusion13. Det skulle vara omöjligt att utföra upprepade endosinjektioner med hjälp av osmotic pumpsystemet. Det finns inget enkelt sätt att spola ut den återstående fångade vätskan efter varje injektion. Den osmotiska pumpen är också begränsad till att leverera blandningar av kompatibla eller enstaka läkemedel och kräver vanligtvis högre volymer läkemedelspreparat för kontinuerlig infusion. Murine Ommaya är däremot utformad för exakta mikroinjektioner så lite som 3 till 7 μL, utan att behöva ta hänsyn till dött utrymme, och det finns ingen begränsning för vilken typ av läkemedel forskare kan använda, inklusive immuncellsterapi. Murine Ommaya minimerar också reagensavfall om ett visst prov är värdefullt och maximerar användningen av den resursen. För alla behandlingsregimer som kräver flera doser av cancerbehandlingar är Murine Ommaya lätt att använda, och det finns minimal risk för infektion eller kirurgiskt missöden, med alternativa metoder för att upprepade gånger komma åt CSF kirurgiskt eller via upprepad leverans med en nål. Murine Ommaya ger forskare flexibilitet att justera läkemedelskoncentrationer och dosfrekvenser och att bedöma målmodulering och studiens varaktighet enligt intresseforskningen.
En begränsning av Murine Ommaya är att forskare kan ha svårt att implantera enheten hos mindre möss. Därför är det bättre att använda möss som är minst 8 till 10 veckor gamla. Det är möjligt för Murine Ommaya att lossna under behandlingsförsöket om enheten inte är fastsatt på skallen under implantationsstegen och limet avtar, eller om mössen har nött manipulering med den. Det senare scenariot inträffar oftare när flera möss var inhyst i samma bur. Därför rekommenderas att inte hysa mer än två Murine Ommaya-implanterade möss per bur under behandlingsschemat. Detta protokoll ändrades för att applicera cyanoakrylat sterilt lim på distansen, som befanns vara det mest effektiva limet för att vidhäfta distansen på skallytan och förhindra Murine Ommaya från att lossna. Resultaten visade att LMD möss gynnades av direkt intratekal terapi via Murine Ommaya, med ökad total överlevnad. Enstaka mikrolitervolymer kan administreras säkert, kringgå BBB, vilket minskar mängden läkemedelspreparat. Viktigast av allt, mössen som botades av CNS metastaser från Her2-antikropp immunterapi studie har förblivit friska.
Ett samarbete med en tillverkare syftade till att utveckla en MR-kompatibel version av Murine Ommaya för PDX-modellen av LMD. Eftersom denna prototypversion har en distans inkorporerad krävs ingen montering, vilket möjliggör bättre anslutning till skallen. En begränsning av denna prototyp är att även om enheten är MR-kompatibel, genererar den en skugga där enheten sätts in, vilket minskar synligheten för bilden för kvantifieringsanalyser. Den MRI-kompatibla versionen är ett bra alternativt verktyg när ex vivo CTC-sampling är en begränsande faktor, och förmärkning av celler är inte genomförbart. Kombinationen av en LMD xenograft modell och Murine Ommaya tekniken är fördelaktigt för att studera direkt riktade läkemedel effektivitet kringgå BBB. Resultaten från dessa in vivo-studier är kliniskt relevanta för att utforma rationella terapeutiska strategier för patienter med LMD.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Michele L. Danielson, Tricia Favors-Watson och resten av komparativ medicinteamet vid University of South Florida för deras tekniska stöd och underhåll av våra djur. Vi tackar Instech Laboratories, Inc. för deras arbete med oss baserat på vår begäran att utveckla en MR-kompatibel Murine Ommaya. Detta arbete stöds av National Institutes of Health (NIH) R21 CA216756 (till K.S.M. Smalley), Department of Defense (DOD) W81XWH1910675 (till B. Czerniecki och P. Kalinski) och Moffitt Cancer Center CBMM Innovative Awards (till P. Forsyth och D. Duckett). Redaktionell hjälp tillhandahölls av Moffitt Cancer Centers Kontor för vetenskapligt skrivande av Dr. Paul Fletcher och Daley Drucker. Ingen ersättning gavs utöver deras ordinarie löner.
1 mm spacer disc | Alzet, Durect Corporation | #0008670 | Spacer disc only |
4-0 ethilon nylon suture | Any vendor | n/a | |
Automatic syringe pumps | Harvard Syringe Pumps (or any vendor) | #70-4505 | Pump 11 Elite |
Bead sterilizer | Braintree Scientific Inc. (or any vendor) | #GER 5287-120V | Germinator 500 |
Buprenorphine Sustained-Release (Bup-SR) | Zoopharm | DEA controlled | |
Cyanoacrylate sterile adhesive | Any vendor | ||
Gas inhalation anestehsia system | VeteEquip | #901812 | COMPAC5 |
Hamilton microliter syringes | Hamilton | 10, 25, 50, and 100 μL | 30 G for cisterna magna injection |
Hydrogen peroxide | Any vendor | n/a | |
IVIS 200 imaging system | Caliper Life Sciences | n/a | |
Magnifying glass with light | Any vendor | n/a | |
Microdrill | Stoelting (or any vendor) | #51555M | |
MRI imaging | Bruker | BioSpec series | Optional |
Murine Ommaya (MRI-compatible) prototype | Instech Laboratories, Inc. | #VAB620-25MRI-3.3 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Any vendor | n/a | 0.1 mm Sterile-Filtered |
PinPort injector | Instech Laboratories, Inc. | #PNP3M-50 | |
PinPort | Instech Laboratories, Inc. | #1-PNP3F28-50 | |
Rodent Surgical Instruments (Scissors, Forceps) | Roboz Surgical Instrument (or any vendor) | ||
Stereotaxic device | Stoelting (or any vendor) | #51730M | |
Sterile blue paper/ drape covering | Any vendor | n/a | n/a |
Sterile cotton sticks | Any vendor | n/a |