הרכבה ותפעול של מכשיר אצוטופלואידי לאספקה משופרת של תרכובות מולקולריות לתאים
Summary
פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה והתפעול של מכשיר אצוטופלואידי בעלות נמוכה עבור משלוח מולקולרי מהיר לתאים באמצעות sonoporation המושרה על ידי סוכני ניגוד אולטרסאונד.
Abstract
אספקה תאית יעילה של ביומולקולים נדרשת למגוון רחב של מחקר ביו-רפואי ויישומים טיפוליים מבוססי תאים. sonoporation בתיווך אולטראסאונד היא טכניקה מתפתחת עבור משלוח תאי מהיר של biomolecules. Sonoporation מתרחשת כאשר cavitation של microbubbles מלא גז יוצר נקבוביות חולפות בקרומי התא הסמוכים, המאפשר ספיגה מהירה של biomolecules מהנוזל שמסביב. הטכניקות הנוכחיות עבור in vitro sonoporation של תאים בהשעיה מוגבלים על ידי תפוקה איטית, שונות בתנאי החשיפה אולטרסאונד עבור כל תא, ועלות גבוהה. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, מכשיר acoustofluidic בעלות נמוכה פותח אשר משלב מתמר אולטרסאונד במכשיר נוזלים מבוסס PDMS כדי לגרום sonoporation עקבי של תאים כפי שהם זורמים דרך הערוצים בשילוב עם סוכני ניגוד אולטרסאונד. המכשיר מפוברק בטכניקות פוטוליתוגרפיה סטנדרטיות כדי לייצר את השבב הנוזלי מבוסס PDMS. מתמר דיסק פיזו אולטרסאונד מחובר למכשיר ומונע על ידי מיקרו-בקר. ניתן לשלב את ההרכבה בתוך מארז מודפס בתלת-ממד להגנה נוספת. תאים ומיקרו-חלוקים נדחפים דרך המכשיר באמצעות משאבת מזרק או משאבה פרייסטלטית המחוברת לצינורות PVC. משלוח משופר של biomolecules לתאי T אנושיים ותאי סרטן ריאות הוא הודגם עם מערכת אצוטופלואידית זו. בהשוואה לגישות טיפול בתפזורת, מערכת אצוטופלוידית זו מגדילה את התפוקה ומפחיתה את השונות, אשר יכול לשפר את שיטות עיבוד התא עבור יישומי מחקר ביו-רפואי וייצור של טיפולים מבוססי תאים.
Introduction
פלטפורמות ויראליות ולא ויראליות נוצלו כדי לשפר את המסירה המולקולרית לתאים. משלוח ויראלי (transduction) היא טכניקה נפוצה המשמשת 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 מגבלות עם משלוח ויראלי כוללות mutagenesis החדרה פוטנציאלית, יכולת מהונדסת מוגבלת, ריבוי לא רצוי של זיהום1,2. לכן, טכניקות משלוח מולקולרי לא ויראליות נמצאות בפיתוח עבור מגוון רחב של יישומי ביו-רפואה ומחקר. טכניקות נפוצות כוללות מכני, חשמלי, הידרודינמי, או שימוש באנרגיה מבוססת לייזר כדי לשפר את ספיגת הביומולקולים לתאים 3. Electroporation היא פלטפורמת משלוח מולקולרית לא ויראלית נפוצה אשר יש את היכולת לגרום ניקוב חולף בקרום הפלזמה עבור משלוח תאי שלתרכובות מולקולריות 4,5,6,7,8,9. עם זאת, ניקוב חולף של קרום הפלזמה הוא תהליך סטוכסטי וספיגה מולקולרית באמצעות אלקטרופורציה תלויה בדרך כלל דיפוזיה פסיבית על פני נקבוביות הממברנה החולפת4,7,8.
שיטה חלופית היא ניצול של אולטרסאונד עבור משלוח מולקולרי תאי משופר באמצעות cavitation של סוכני ניגוד אולטרסאונד (כלומר, microbubbles מלא גז). cavitation microbubble גורם אפקטים microstreaming במדיה שמסביב אשר יכול לגרום ניקוב חולף של ממברנות פלזמה סמוכות (“sonoporation”) המאפשר ספיגה תאית מהירה של biomolecules באמצעות מנגנוני תחבורה פסיביים או פעילים10,11,12. Sonoporation היא טכניקה יעילה עבור משלוח מולקולרי מהיר לתאים, אבל גישה זו דורשת לעתים קרובות ציוד יקר ושיטות טיפול בתפזורת אשר מוגבלים על ידי תפוקה נמוכה יותר ושונות גבוהה יותר בתנאיחשיפה אולטרסאונד 13. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, התקנים acoustofluidic, המאפשרים sonoporation עקבי של תאים בהשעיה, נמצאים כעת בפיתוח.
Acoustofluidics הוא תחום מתרחב המשלב אולטרסאונד וטכנולוגיות microfluidic עבור מגוון רחב של יישומים. גישה זו שימשה בעבר להפרדת חלקיקים על ידי החלת אנרגיית אולטרסאונד רציפה כדי לגרום לגלים אקוסטיים עומדים בתוך הערוצים הנוזליים14,15,16,17. חלקיקים ממוינים לחלקים שונים של המכשיר בהתבסס על מגוון מאפיינים כגון גודל החלקיקים, צפיפות ודחיסה ביחס למדיום16. טכנולוגיות Acoustofluidic נמצאים גם בפיתוח כדי לאפשר אספקה מולקולרית מהירה למגוון סוגי תאים עבור יישומי מחקר וייצור של שירותי תאים18. לאחרונה, הדגמנו משלוח מולקולרי משופר לאריתרוציטים באמצעות מכשיר אצוטופלואידי מבוסס PDMS19. בפלטפורמה האקוסטופולידית, ניתן לתמרן את הדינמיקה של התא והמיקרו-יבלים כדי לגרום לאינטראקציות פיזיות המאפשרות אספקה משופרת של ביומולקולים. היעילות והעקביות של אספקה מולקולרית תאית יכולות להיות מוגברות על ידי אופטימיזציה של המרחק בין תאים ומיקרו-יבלים.
יישום חשוב אחד עבור sonoporation בתיווך אצוטופלואידי כרוך הובלה של biomolecules לתוך תאי T אנושיים ראשוניים. אימונותרפיות המבוססות על העברת תאי T מאמצת, כגון טיפול בתא T קולטן אנטיגן כימרי (CAR T), מתעוררות במהירות לטיפול במחלות שונות, כולל סרטן ווירוסים כגון HIV20. טיפול CAR T היה יעיל במיוחד בחולי לוקמיה לימפובלסטית חריפה בילדים (ALL), עם שיעורי הפוגה מלאה של 70-90%21. עם זאת, ייצור תאי T לטיפולים אלה תלוי בדרך כלל בהתמרות ויראלית המוגבלת על ידי מוטגנזה פוטנציאלית, זמני עיבוד ארוכים ואתגרים של אספקת ביומולקולות לא גנטיות כגון חלבונים או מולקולות קטנות1. שיטות אספקה מולקולריות בתיווך אצטופולי יכול להתגבר על מגבלות אלה ולשפר את הייצור של טיפולים בתאי T.
יישום חשוב נוסף עבור sonoporation בתיווך אצוטופלואידי כרוך משלוח תאי של תרכובות משמרות, כגון trehalose, אשר להגן על תאים במהלך הקפאה וייבוש. Trehalose מיוצר על ידי כמה אורגניזמים בטבע ומסייע להם לסבול הקפאה וייבוש על ידי הגנה על הממברנות התאיות שלהם22,23. עם זאת, trehalose אינו מיוצר על ידי תאים יונקים והוא אטום קרום התא יונקים. לכן, טכניקות משלוח מולקולרי יעיל, כגון sonoporation, נחוצים על מנת להשיג רמות טרהלוז תאיות מספיק הנדרש כדי להגן על ממברנות תאיות פנימיות. גישה זו נמצאת כעת בפיתוח לשימור יבש של סוגי תאים שונים.
פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של ההרכבה וההפעלה של מערכת אקוסטופלואידית בעלות נמוכה יחסית המונעת על ידי מיקרו-בקר. סוכני ניגודיות אולטראסאונד מנוצלים כדי לגרום sonoporation בתוך הערוצים הנוזליים ולאפשר משלוח מולקולרי מהיר לסוגי תאים שונים, כולל תאי T ותאים סרטניים. מערכת אצוטופלוידית זו יכולה לשמש עבור מגוון יישומי מחקר, עשוי גם להיות שימושי כמערכת אב טיפוס להערכת שיטות sonoporation עבור תהליכי ייצור טיפול בתאים משופרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה והתפעול של מערכת אצוטופלוידית בעלות נמוכה אשר משפרת את המסירה התאית של biomolecules עבור יישומי מחקר. ישנם מספר גורמים חשובים שיש לקחת בחשבון בעת הרכבה והפעלה של מערכת זו. המכשיר acoustofluidic הוא מפוברק PDMS, שהוא חומר תואם ביולוגית שניתן לעצב בקלות עם מידות ערוץעק?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה במימון הקרן הלאומית למדע (#1827521, #1827521, #1450370) ומכוני הבריאות הלאומיים (U01HL127518). שירותי פוטוליתוגרפיה ניתנו על ידי המרכז הטכנולוגי מיקרו / ננו של אוניברסיטת לואיוויל.
Materials
| Fabrication of Acoustofluidic Device | |||
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris Uni-Core (2.5 mm) | Electron Microscopy Sciences | 69039-25 | |
| Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube – S (2/4 port) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| Microscope Slide | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| trichlorosilane | Gelest | 105732-02-3 (Cas. No.) | Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. |
| Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Part #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| Assembly of Acoustofluidic System | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (Barcode) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| Preparation of Ultrasound Contrast Agents | |||
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) | Avanti Lipids | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP (decafluorobutate gas) | FlouroMed | 355-25-9 (Cas No.) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 Amalgamators | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| polyoxyethylene 40 stearate | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 Sonicator | Qsonica | Q125-110 (Ref.) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r |
| Preparation of Primarty T Cells | |||
| autoMACs running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| Preparation of A549 Lung Cancer Cells | |||
| Trehalose Assay Kit | Megazyme | K-TREH (Cat. No.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) | VWR | 97063-702 (Cat. No.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
References
- Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
- Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells. Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).
- Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Advanced Biomedical Research. 1, 27 (2012).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Medical & Biological Engineering & Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).
- Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).
- Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. C. Simulation and experimental demonstration of the electric field assisted electroporation microchip for in vitro gene delivery enhancement. Lab on a Chip. 4 (2), 104-108 (2004).
- Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophysical Chemistry. 19 (3), 211-225 (1984).
- Weaver, J. C. Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 51 (4), 426-435 (1993).
- Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
- Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
- Klibanov, A. L., Shevchenko, T. I., Raju, B. I., Seip, R., Chin, C. T. Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs: a tool for targeted drug delivery. Journal of Controlled Release. 148 (1), 13-17 (2010).
- Fan, Z., Kumon, R. E., Deng, C. X. Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and gene delivery. Therapeutic Delivery. 5 (4), 467-486 (2014).
- Secomski, W., et al. In vitro ultrasound experiments: Standing wave and multiple reflections influence on the outcome. Ultrasonics. 77, 203-213 (2017).
- Gedge, M., Hill, M. Acoustofluidics 17: theory and applications of surface acoustic wave devices for particle manipulation. Lab on a Chip. 12 (17), 2998-3007 (2012).
- Shi, J., et al. Acoustic tweezers: patterning cells and microparticles using standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (20), 2890-2895 (2009).
- Shi, J., Huang, H., Stratton, Z., Huang, Y., Huang, T. J. Continuous particle separation in a microfluidic channel via standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (23), 3354-3359 (2009).
- Shields, C. W. t., Cruz, D. F., Ohiri, K. A., Yellen, B. B., Lopez, G. P. Fabrication and operation of acoustofluidic devices supporting bulk acoustic standing waves for sheathless focusing of particles. Journal of Visualized Experiments. (109), e53861 (2016).
- Belling, J. N., et al. Acoustofluidic sonoporation for gene delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (20), 10976-10982 (2020).
- Centner, C. S., et al. Ultrasound-induced molecular delivery to erythrocytes using a microfluidic system. Biomicrofluidics. 14 (2), 024114 (2020).
- Qi, J., Ding, C., Jiang, X., Gao, Y. Advances in developing CAR T-cell therapy for HIV cure. Frontiers in Immunology. 11, 361 (2020).
- Annesley, C. E., Summers, C., Ceppi, F., Gardner, R. A. The evolution and future of CAR T cells for B-Cell Acute lymphoblastic leukemia. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (4), 591-598 (2018).
- Hand, S. C., Menze, M. A. Molecular approaches for improving desiccation tolerance: insights from the brine shrimp Artemia franciscana. Planta. 242 (2), 379-388 (2015).
- Zhang, M., et al. Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: preservation of DNA integrity. Scientific Reports. 7 (1), 6198 (2017).
- Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality. Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).
- Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Current Protocol in Stem Cell Biology. , (2007).
- Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on Percoll. Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
- Kopechek, J. A., et al. Ultrasound targeted microbubble destruction-mediated delivery of a transcription factor decoy inhibits STAT3 signaling and tumor growth. Theranostics. 5 (12), 1378-1387 (2015).
- Bhutto, D. F., et al. Effect of molecular weight on sonoporation-mediated uptake in human cells. Ultrasound in Medical Biology. 44 (12), 2662-2672 (2018).
- Forbes, M. M., Steinberg, R. L., O’Brien, W. D. Frequency-dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells. Journal of Ultrasound in Medicine. 30 (1), 61-69 (2011).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Miller, D. L., Bao, S., Morris, J. E. Sonoporation of cultured cells in the rotating tube exposure system. Ultrasound in Medical Biology. 25 (1), 143-149 (1999).
