生物组织样本的串行块面扫描电子显微镜 （SBF-SEM）

Summary

该协议概述了使用串行块面扫描电子显微镜 （SBF-SEM） 的常规方法，这是一种强大的 3D 成像技术。SBF-SEM 的成功应用取决于适当的固定和组织染色技术，以及仔细考虑成像设置。本协议包含整个过程的实际考虑。

Abstract

串行块面扫描电子显微镜 （SBF-SEM） 可收集数百到数千张连续注册的超结构图像，为组织显微解剖提供前所未有的三维视图。虽然 SBF-SEM 近年来的使用呈指数级增长，但适当的组织制备和成像参数等技术方面对于这种成像模式的成功至关重要。此成像系统受益于设备的自动化性质，允许显微镜在成像过程中无人看管，并在一天内自动收集数百张图像。然而，如果没有适当的组织制备，细胞超结构可能会被改变，以得出不正确或误导性的结论。此外，图像是通过扫描树脂嵌入生物样本的块面生成的，这通常会带来必须解决的挑战和考虑。成像过程中块内电子的积累，称为”组织充电”，可导致对比度损失和无法欣赏细胞结构。此外，虽然增加电子束强度/电压或降低光束扫描速度可以增加图像分辨率，但这也可能产生破坏树脂块和扭曲成像系列中后续图像的不幸副作用。在这里，我们提出了一个常规协议，准备生物组织样本，以保持细胞超结构和减少组织充电。我们还为快速获取高质量的序列图像提供成像考虑，对组织块的损害最小。

Introduction

1981年，莱顿首次描述了串行块面扫描电子显微镜（SBF-SEM），他设计了一个扫描电子显微镜，该显微镜由内置的显微原子增强，可以切割和成像嵌入树脂中的组织薄部分。不幸的是，技术限制限制其使用导电样品，因为非导电样品，如生物组织积累不可接受的充电水平（电子积累在组织样本^）1。虽然用蒸发的碳减少组织充电在切割之间涂上块面，但这大大增加了成像采集时间和图像存储仍然是一个问题，因为当时的计算机技术不足以管理设备创建的大文件大小。2004年，登克和霍斯特曼使用装有可变压力室²的SBF-SEM重新审视了这一方法。这允许将水蒸气引入成像室，从而减少样品内部的充电，使非导电样品的成像可行，尽管图像分辨率会丢失。组织制备和成像方法的进一步改进现在允许使用高真空成像，SBF-SEM成像不再依赖水蒸气来消散充电^{3，4，5，6，7，8，9。}虽然 SBF-SEM 近年来的使用呈指数级增长，但适当的组织制备和成像参数等技术方面对于这种成像模式的成功至关重要。

SBF-SEM 允许自动收集数千个串行注册的电子显微镜图像，平面分辨率小至 3-5 nm^10，11。组织，浸渍重金属和嵌入树脂，被放置在扫描电子显微镜（SEM）内，其中含有装有钻石刀的超微观。平坦的表面用钻石刀切割，刀被收回，块的表面被扫描在一个带电子束的刺刀图案中，以创建组织超结构的图像。然后，该块在 z 轴中提升指定量（例如 100 nm），称为”z 步”，在重复过程之前切割新表面。这样，当组织被切断时，会产生一个三维（3D）图像块。此成像系统进一步受益于设备的自动化性质，使显微镜在成像过程中无人看管，一天内可以自动收集数百张图像。

虽然SBF-SEM成像主要使用背散射电子形成块面图像，但二次电子是在成像过程中产生的^。次要电子可以积累，与背散射和原光束电子一起，无法逃离方块，并产生”组织充电”，这可能导致块面的局部静电场。这种电子积累可以扭曲图像或导致电子从方块中弹出，并有助于后散射探测器收集的信号，降低信号与噪声的比例^13。虽然通过降低电子束电压或强度或减少光束停留时间可以降低组织充电水平，但这会导致信号与噪声比^{减少 14}。当使用低电压或强度的电子束，或者光束只允许在每个像素空间内停留较短的时间时，从组织中弹出的背散电子较少，并被电子探测器捕获，导致信号较弱。Denk 和 Horstmann 通过将水蒸气引入室内来解决这个问题，从而以图像分辨率为代价降低了房间和块面的电荷。由于腔室压力为10-100 Pa，电子束的一部分是分散的，导致图像噪声和分辨率的丧失，然而，这也产生离子在标本室中和电荷在样品块^2。在成像过程中，样品块内的中和电荷使用焦气喷射到块面上，或将负电压引入SBF-SEM阶段，以降低探针束拉升能量，增加收集^{的信号6、7、15。}与其引入阶段偏置、腔室压力或局部氮注入来减少块表面的电荷积聚，还可以通过将碳引入树脂混合物来增加树脂的导电性，从而允许更积极的成像设置^16。以下一般协议是2010年发布的Deerinck等人协议的改编，涵盖了对组织制备和成像方法的修改，我们发现在保持高分辨率图像采集^{3、17、18、19}的同时，最大限度地减少组织充电是有用的。虽然前面提到的协议侧重于组织处理和重金属浸渍，但该协议提供了对 SBF-SEM 研究固有的成像、数据分析和重建工作流程的洞察。在我们的实验室中，此协议已成功并可重复应用于各种组织，包括角膜和前段结构， 眼睑，胆小和硬质腺，视网膜和视神经，心脏，肺和气道，肾脏，肝脏，肌骨质，和大脑皮层/梅杜拉，并在各种物种，包括老鼠，大鼠，兔子，豚鼠，鱼，单层和分层细胞培养，猪，非人类灵长类动物，以及人类20，21，22，23。虽然对于特定的组织和应用来说，小的变化可能是值得的，但事实证明，在我们核心成像设施的背景下，此通用协议具有高度可复制性和有用性。

Protocol

所有动物均按照视觉和眼科研究协会《视觉和眼科研究声明》和休斯顿大学光学学院动物处理指南中描述的指南处理。所有动物程序均由处理机构批准：鼠、鼠、兔、豚鼠和非人类灵长类动物程序均由休斯顿大学动物护理和使用委员会批准，斑马鱼程序由德保大学动物护理和使用委员会批准，猪程序由贝勒医学院动物护理和使用委员会批准。所有人体组织均按照《赫尔辛基关于人体组织研究的宣?…

Representative Results

鼠标科内亚此协议已广泛应用于小鼠角膜。使用 SBF-SEM 成像，显示成人小鼠角膜内存在无弹性蛋白微纤维束 （EFMB） 网络。以前认为，该网络仅在胚胎和产后早期发育期间存在。SBF-SEM 揭示了整个角膜中广泛的 EFMB 网络，在横截面测量时，发现单个纤维的直径为 100-200 nm。还发现，这个EFMB网络是组织在不同的层，纤维与角细胞紧密相连，甚至躺在角细胞表面的浅入侵（<strong class="xf…

Discussion

本文的目的是突出组织制备和成像方法，使我们的实验室能够可靠地捕获高分辨率串行电子显微镜图像，并指出导致这一结果的关键步骤以及进行 SBF-SEM 成像时可能发生的潜在陷阱。使用此协议的成功需要正确固定组织、将重金属浸渍到样品中、修改嵌入树脂以减少充电，以及了解用于收集图像的显微镜和成像设置。格言，”质量在，质量出”是SBF-SEM成像的合适公理。由于 SBF-SEM 的目标通常是对超?…

Materials

1/16 x 3/8 Aluminum Rivets	Industrial Rivet & Fastener Co.	6N37RFLAP/1100	Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver	Wiha Quality Tools	27225
Acetone	Electron Microscopy Sciences	RT 10000	Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid	Sigma-Aldrich	A8949
Calcium Chloride	FisherScientific	C79-500
Conductive Silver Paint	Ted Pella	16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target	Denton Vacuum	N/A	This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors	Fisher Scientific	50-949-411
Embed 812	Electron Microscopy Sciences	14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM	Gatan & Tescan	N/A	This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml)	Electron Microscopy Sciences	72630-05
Gluteraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16320
Gorilla Super Glue – Impact Tough	NA	NA	Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black	HM Royal	EC-600JD	Refered to as carbon black in text.
KOH	FisherScientific	18-605-593
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L62-100
Microwave	Pelco	BioWave Pro	This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide	Sigma-Aldrich	201030
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P9387
Silicone Embedding Mold	Ted Pella	10504
Sodium Cacodylate Trihydrate	Electron Microscopy Sciences	12300
Samco Transfer Pipette	ThermoFisher Scientific	202	Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files	Electron Microscopy Sciences	62115
Thiocarbohydrazide	Sigma-Aldrich	223220
Uranyl Acetate	Polysciences, Inc.	21447-25
Reconstruction Software
Amira Software	Thermo Scientific	N/A	Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ)	ImageJ.net	N/A	TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB)	University of Helsinki, Institute of Biotechnology	N/A
Reconstuct Software	Neural Systems Lab	N/A
SuRVoS Workbench	Diamond Light Source & The University of Nottingham	N/A
SyGlass	IstoVisio, Inc.	N/A	Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.