JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopie (SBF-SEM) van biologische weefselmonsters

Published: March 26, 2021
doi:
10.3791/62045
, , , , , , ,
1College of Optometry,University of Houston, 2Department of Biology,DePauw University, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID),Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 4Children’s Nutrition Center,Baylor College of Medicine

Summary

Dit protocol schetst een routinemethode voor het gebruik van seriële blok-gezicht scanning elektronenmicroscopie (SBF-SEM), een krachtige 3D-beeldvormingstechniek. Succesvolle toepassing van SBF-SEM hangt af van de juiste fixatie- en weefselkleuringstechnieken, evenals zorgvuldige overweging van beeldvormingsinstellingen. Dit protocol bevat praktische overwegingen voor het gehele proces.

Abstract

Serial block-face scanning electron microscopie (SBF-SEM) maakt het mogelijk om honderden tot duizenden serieel geregistreerde ultrastructurele beelden te verzamelen, wat een ongekend driedimensionaal beeld biedt van weefselmicroanatomie. Hoewel SBF-SEM de afgelopen jaren een exponentiële toename van het gebruik heeft gezien, zijn technische aspecten zoals een goede weefselvoorbereiding en beeldvormingsparameters van het grootste belang voor het succes van deze beeldvormingsmodaliteit. Dit beeldvormingssysteem profiteert van het geautomatiseerde karakter van het apparaat, waardoor men de microscoop onbeheerd kan achterlaten tijdens het beeldvormingsproces, met de geautomatiseerde verzameling van honderden beelden mogelijk op één dag. Zonder de juiste weefselvoorbereiding kan de cellulaire ultrastructuur echter zodanig worden gewijzigd dat onjuiste of misleidende conclusies kunnen worden getrokken. Bovendien worden afbeeldingen gegenereerd door het blokvlak van een met hars ingebed biologisch monster te scannen en dit brengt vaak uitdagingen en overwegingen met zich mee die moeten worden aangepakt. De accumulatie van elektronen in het blok tijdens beeldvorming, bekend als “weefsel opladen”, kan leiden tot een verlies van contrast en een onvermogen om cellulaire structuur te waarderen. Bovendien kan het verhogen van de intensiteit/spanning van elektronenbundels of het verlagen van de stralingsscansnelheid de beeldresolutie verhogen, maar dit kan ook de ongelukkige bijwerking hebben van het beschadigen van het harsblok en het vervormen van latere beelden in de beeldvormingsreeks. Hier presenteren we een routineprotocol voor de voorbereiding van biologische weefselmonsters die cellulaire ultrastructuur behouden en het opladen van weefsel verminderen. We bieden ook beeldvormingsoverwegingen voor de snelle verwerving van hoogwaardige seriële beelden met minimale schade aan het weefselblok.

Introduction

Serial block face scanning electron microscopie (SBF-SEM) werd voor het eerst beschreven door Leighton in 1981, waar hij een scanning elektronenmicroscoop maakte, aangevuld met een ingebouwde microtome die dunne delen weefsel ingebed in hars kon snijden en in beeld kon snijden. Helaas beperkten technische beperkingen het gebruik ervan tot geleidende monsters, omdat niet-geleidende monsters zoals biologisch weefsel onaanvaardbare oplaadniveaus (elektronenopbouw in het weefselmonster)1. Terwijl het coaten van de blokwand tussen sneden met verdampte koolstof verminderde weefsel opladen, deze sterk verhoogde beeldverwervingstijd en beeldopslag bleef een probleem omdat computertechnologie op dat moment onvoldoende was om de grote bestandsgroottes die door het apparaat werden gecreëerd te beheren. Deze methodiek is in 2004 door Denk en Horstmann opnieuw bekeken met behulp van een SBF-SEM uitgerust met een variabele drukkamer2. Dit maakte de introductie van waterdamp in de beeldvormingskamer mogelijk, waardoor het opladen in het monster werd beperkt, waardoor beeldvorming van niet-geleidende monsters levensvatbaar werd, zij het met verlies van beeldresolutie. Verdere verbeteringen in weefselvoorbereidings – en beeldvormingsmethoden maken het nu mogelijk om beeldvorming met behulp van hoog vacuüm mogelijk te maken, en SBF-SEM-beeldvorming is niet langer afhankelijk van waterdamp om het opladen3,4,5,6,7,8,9af te voeren . Hoewel SBF-SEM de afgelopen jaren een exponentiële toename van het gebruik heeft gezien, zijn technische aspecten zoals een goede weefselvoorbereiding en beeldvormingsparameters van het grootste belang voor het succes van deze beeldvormingsmodaliteit.

SBF-SEM maakt de geautomatiseerde verzameling van duizenden serieel geregistreerde elektronenmicroscopiebeelden mogelijk, met een planaire resolutie van 3-5 nm10,11. Weefsel, geïmpregneerd met zware metalen en ingebed in hars, wordt geplaatst in een scanning elektronenmicroscoop (SEM) met een ultramicrotome uitgerust met een diamantmes. Een vlak oppervlak wordt gesneden met het diamantmes, het mes wordt ingetrokken en het oppervlak van het blok wordt gescand in een rasterpatroon met een elektronenstraal om een beeld van weefsel ultrastructuur te creëren. Het blok wordt vervolgens een bepaalde hoeveelheid (bijv. 100 nm) in de z-as verhoogd, bekend als een “z-stap”, en een nieuw oppervlak wordt gesneden voordat het proces wordt herhaald. Op deze manier wordt een 3-dimensionaal (3D) blok beelden geproduceerd terwijl het weefsel wordt weggesneden. Dit beeldvormingssysteem profiteert verder van het geautomatiseerde karakter van het apparaat, waardoor men de microscoop onbeheerd kan achterlaten tijdens het beeldvormingsproces, met de geautomatiseerde verzameling van honderden beelden mogelijk op één dag.

Terwijl SBF-SEM-beeldvorming voornamelijk backscattered elektronen gebruikt om een beeld van het blokvlak te vormen, worden secundaire elektronen gegenereerd tijdens het beeldvormingsproces12. Secundaire elektronen kunnen zich ophopen, naast backscattered en primaire-bundel elektronen die niet ontsnappen aan het blok, en produceren “weefsel opladen,” die kan leiden tot een gelokaliseerd elektrostatisch veld aan de block-face. Deze elektronenaccumulatie kan het beeld vervormen of ervoor zorgen dat elektronen uit het blok worden geworpen en bijdragen aan het signaal dat door de backscatterdetector wordt verzameld, waardoor de signaal-ruisverhouding wordt verlaagd13. Hoewel het niveau van weefsellading kan worden verlaagd door de spanning of intensiteit van de elektronenbundel te verminderen of de verblijftijd van de bundel te verkorten, resulteert dit in een verminderde signaal-ruisverhouding14. Wanneer een elektronenbundel met een lagere spanning of intensiteit wordt gebruikt, of de bundel slechts gedurende een kortere periode in elke pixelruimte mag blijven hangen, worden minder teruggetrokken elektronen uit het weefsel geworpen en door de elektronendetector opgevangen, wat resulteert in een zwakker signaal. Denk en Horstmann hebben dit probleem aangepakt door waterdamp in de kamer te brengen, waardoor de lading in de kamer en op het blokgezicht wordt verminderd ten koste van de beeldresolutie. Bij een kamerdruk van 10-100 Pa wordt een deel van de elektronenbundel verspreid, wat bijdraagt aan beeldruis en een verlies van resolutie, maar dit produceert ook ionen in de monsterkamer die de lading binnen het monsterblok neutraliseren2. Recentere methoden voor het neutraliseren van lading binnen het monsterblok gebruiken focale gasinjectie van stikstof over het blokvlak tijdens beeldvorming, of het introduceren van negatieve spanning in het SBF-SEM-stadium om de energie van de sondestraallading te verminderen en het verzamelde signaal te verhogen6,7,15. In plaats van stadiumbias, kamerdruk of gelokaliseerde stikstofinjectie te introduceren om de ladingsopbouw op het blokoppervlak te verminderen, is het ook mogelijk om de geleidbaarheid van de hars te verhogen door koolstof in de harsmix te introduceren, waardoor agressievere beeldvormingsinstellingen mogelijk zijn16. Het volgende algemene protocol is een aanpassing van het in 2010 gepubliceerde Deerinck et al.-protocol en omvat wijzigingen in weefselvoorbereidings – en beeldvormingsmethoden die we nuttig vonden voor het minimaliseren van weefselladen met behoud van beeldverwerving met hoge resolutie3,17,18,19. Hoewel het eerder genoemde protocol gericht was op weefselverwerking en impregneren van zware metalen, biedt dit protocol inzicht in de beeldvormings-, gegevensanalyse- en reconstructieworkflow die inherent is aan SBF-SEM-studies. In ons laboratorium, dit protocol is met succes en reproduceerbaar toegepast op een breed scala van weefsels, waaronder hoornvlies en voorste segment structuren, ooglid, traan en harderian klier, netvlies en oogzenuw, hart, long en luchtwegen, nier, lever, cremaster spier, en cerebrale cortex / medulla, en in een verscheidenheid van soorten, waaronder muis, rat, konijn, cavia, vis, monolayer en gelaagde celculturen, varken, niet-menselijke primaat, evenals mens2. Hoewel kleine veranderingen de moeite waard kunnen zijn voor specifieke weefsels en toepassingen, is dit algemene protocol zeer reproduceerbaar en nuttig gebleken in de context van onze kernbeeldvormingsfaciliteit.

Protocol

Alle dieren werden behandeld volgens de richtlijnen beschreven in de Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Vision and Ophthalmic Research en de University of Houston College of Optometry animal handling guidelines. Alle dierprocedures werden goedgekeurd door de instellingen waar ze werden behandeld: muis-, ratten-, konijnen-, cavia- en niet-menselijke primatenprocedures werden goedgekeurd door de University of Houston Animal Care and Use Committee, zebravisprocedures wer…

Representative Results

Muis CorneaDit protocol is uitgebreid toegepast op het hoornvlies van de muis. Met behulp van SBF-SEM-beeldvorming bleek een netwerk van elastinevrije microfibrilbundels (EFMBs) aanwezig te zijn in het volwassen muis hoornvlies. Eerder werd aangenomen dat dit netwerk alleen aanwezig was tijdens embryonale en vroege postnatale ontwikkeling. SBF-SEM onthulde een uitgebreid EFMB-netwerk in het hele hoornvlies, met individuele vezels met een diameter van 100-200 nm wanneer gemeten in doorsnede. Er werd o…

Discussion

Het doel van dit methodedocument is om de weefselvoorbereidings- en beeldvormingsmethodologie te benadrukken die ons lab in staat heeft gesteld om op betrouwbare wijze seriële elektronenmicroscopiebeelden met hoge resolutie vast te leggen, en om te wijzen op kritieke stappen die tot dit resultaat leiden, evenals mogelijke valkuilen die kunnen optreden bij het uitvoeren van SBF-SEM-beeldvorming. Succes met behulp van dit protocol vereist een goede fixatie van weefsel, impregnatie van zware metalen in het monster, wijzigi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We willen Dr. Sam Hanlon, Evelyn Brown en Margaret Gondo bedanken voor hun uitstekende technische assistentie. Dit onderzoek werd deels ondersteund door National Institutes of Health (NIH) R01 EY-018239 en P30 EY007551 (National Eye Institute), deels door de Lion’s Foundation for Sight, en deels door NIH 1R15 HD084262-01 (National Institute of Child Health &Human Development).

Materials

1/16 x 3/8 Aluminum Rivets Industrial Rivet & Fastener Co. 6N37RFLAP/1100 Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver Wiha Quality Tools 27225
Acetone Electron Microscopy Sciences RT 10000 Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid Sigma-Aldrich A8949
Calcium Chloride FisherScientific C79-500
Conductive Silver Paint Ted Pella 16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target Denton Vacuum N/A This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors Fisher Scientific 50-949-411
Embed 812 Electron Microscopy Sciences 14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM Gatan & Tescan N/A This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml) Electron Microscopy Sciences 72630-05
Gluteraldehyde Electron Microscopy Sciences 16320
Gorilla Super Glue – Impact Tough NA NA Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black HM Royal EC-600JD Refered to as carbon black in text.
KOH FisherScientific 18-605-593
Lead Nitrate Fisher Scientific L62-100
Microwave Pelco BioWave Pro This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide Sigma-Aldrich 201030
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich P9387
Silicone Embedding Mold Ted Pella 10504
Sodium Cacodylate Trihydrate Electron Microscopy Sciences 12300
Samco Transfer Pipette ThermoFisher Scientific 202 Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files Electron Microscopy Sciences 62115
Thiocarbohydrazide Sigma-Aldrich 223220
Uranyl Acetate Polysciences, Inc. 21447-25
Reconstruction Software
Amira Software Thermo Scientific N/A Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ) ImageJ.net N/A TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB) University of Helsinki, Institute of Biotechnology N/A
Reconstuct Software Neural Systems Lab N/A
SuRVoS Workbench Diamond Light Source & The University of Nottingham N/A
SyGlass IstoVisio, Inc. N/A Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM – a technical note. Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).
  2. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLOS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  3. He, Q., Hsueh, M., Zhang, G., Joy, D. C., Leapman, R. D. Biological serial block face scanning electron microscopy at improved z-resolution based on Monte Carlo model. Scientific Reports. 8 (1), 12985 (2018).
  4. Zankel, A., Wagner, J., Poelt, P. Serial sectioning methods for 3D investigations in materials science. Micron. 62, 66-78 (2014).
  5. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  6. Ohta, K., et al. Beam deceleration for block-face scanning electron microscopy of embedded biological tissue. Micron. 43 (5), 612-620 (2012).
  7. Bouwer, J. C., et al. Deceleration of probe beam by stage bias potential improves resolution of serial block-face scanning electron microscopic images. Advanced Structural and Chemical Imaging. 2 (1), 11 (2017).
  8. Kizilyaprak, C., Longo, G., Daraspe, J., Humbel, B. M. Investigation of resins suitable for the preparation of biological sample for 3-D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 189 (2), 135-146 (2015).
  9. Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems. Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).
  10. Biazik, J., Vihinen, H., Anwar, T., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. The versatile electron microscope: an ultrastructural overview of autophagy. Methods. 75, 44-53 (2015).
  11. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  12. Piňos, J., Mikmeková, &. #. 3. 5. 2. ;., Frank, L. About the information depth of backscattered electron imaging. Journal of Microscopy. 266 (3), 335-342 (2017).
  13. Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).
  14. Goggin, P., et al. Development of protocols for the first serial block-face scanning electron microscopy (SBF SEM) studies of bone tissue. Bone. 131, 115107 (2020).
  15. Deerinck, T. J., et al. High-performance serial block-face SEM of nonconductive biological samples enabled by focal gas injection-based charge compensation. Journal of Microscopy. 270 (2), 142-149 (2018).
  16. Nguyen, H. B., et al. Conductive resins improve charging and resolution of acquired images in electron microscopic volume imaging. Scientific Reports. 6, 23721 (2016).
  17. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. National Center for Microscopy and Imaging Research. 6 (8), (2010).
  18. Deerinck, T. J., et al. Enhancing Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Enable High Resolution 3-D Nanohistology of Cells and Tissues. Microscopy and Microanalysis. 16, 1138-1139 (2010).
  19. Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
  20. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy: A provocative technique to define 3-dimensional ultrastructure of microvascular thrombosis. Thrombosis Research. 196, 519-522 (2020).
  21. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy reveals neuronal-epithelial cell fusion in the mouse cornea. PLoS One. 14 (11), 0224434 (2019).
  22. Lafontant, P. J., et al. Cardiac Myocyte Diversity and a Fibroblast Network in the Junctional Region of the Zebrafish Heart Revealed by Transmission and Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. PLoS One. 8 (8), 72388 (2013).
  23. Hanlon, S. D., Behzad, A. R., Sakai, L. Y., Burns, A. R. Corneal stroma microfibrils. Experimental Eye Research. 132, 198-207 (2015).
  24. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  25. Davenport, A. T., Grant, K. A., Szeliga, K. T., Friedman, D. P., Daunais, J. B. Standardized method for the harvest of nonhuman primate tissue optimized for multiple modes of analyses. Cell Tissue Bank. 15 (1), 99-110 (2014).
  26. Schuster, A., et al. An isolated perfused pig heart model for the development, validation and translation of novel cardiovascular magnetic resonance techniques. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 12 (1), 53 (2010).
  27. Hanlon, S. D., Patel, N. B., Burns, A. R. Assessment of postnatal corneal development in the C57BL/6 mouse using spectral domain optical coherence tomography and microwave-assisted histology. Experimental Eye Research. 93 (4), 363-370 (2011).
  28. Longiéras, N., Sebban, M., Palmas, P., Rivaton, A., Gardette, J. L. Multiscale approach to investigate the radiochemical degradation of epoxy resins under high-energy electron-beam irradiation. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 44 (2), 865-887 (2006).
  29. Hashimoto, T., Thompson, G. E., Zhou, X., Withers, P. J. 3D imaging by serial block face scanning electron microscopy for materials science using ultramicrotomy. Ultramicroscopy. 163, 6-18 (2016).
  30. Rouquette, J., et al. Revealing the high-resolution three-dimensional network of chromatin and interchromatin space: A novel electron-microscopic approach to reconstructing nuclear architecture. Chromosome Research. 17 (6), 801 (2009).
  31. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
  32. Katoh, K. Microwave-Assisted Tissue Preparation for Rapid Fixation, Decalcification, Antigen Retrieval, Cryosectioning, and Immunostaining. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2016, 7076910 (2016).
  33. Login, G. R., Dvorak, A. M. A review of rapid microwave fixation technology: its expanding niche in morphologic studies. Scanning. 15 (2), 58-66 (1993).
  34. Jamur, M. C., Faraco, C. D., Lunardi, L. O., Siraganian, R. P., Oliver, C. Microwave fixation improves antigenicity of glutaraldehyde-sensitive antigens while preserving ultrastructural detail. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 307-311 (1995).
  35. Leong, A. S., Sormunen, R. T. Microwave procedures for electron microscopy and resin-embedded sections. Micron. 29 (5), 397-409 (1998).
  36. Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).
  37. Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
  38. Belazi, D., Solé-Domènech, S., Johansson, B., Schalling, M., Sjövall, P. Chemical analysis of osmium tetroxide staining in adipose tissue using imaging ToF-SIMS. Histochemistry and Cell Biology. 132 (1), 105-115 (2009).
  39. Rivlin, P. K., Raymond, P. A. Use of osmium tetroxide-potassium ferricyanide in reconstructing cells from serial ultrathin sections. Journal of Neuroscience Methods. 20 (1), 23-33 (1987).
  40. Aguas, A. P. The use of osmium tetroxide-potassium ferrocyanide as an extracellular tracer in electron microscopy. Stain Technology. 57 (2), 69-73 (1982).
  41. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid–containing membranes and droplets in osmium tetroxide–fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
  42. Watson, M. L. Staining of tissue sections for electron microscopy with heavy metals. II. Application of solutions containing lead and barium. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 4 (6), 727-730 (1958).
  43. Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy. Scanning Microscopy in Nanotechnology. , 1-40 (2006).
  44. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  45. Buchacker, T., et al. Assessment of the Alveolar Capillary Network in the Postnatal Mouse Lung in 3D Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Frontiers in Physiology. 10, 1357 (2019).
  46. Keeling, E., et al. 3D-Reconstructed Retinal Pigment Epithelial Cells Provide Insights into the Anatomy of the Outer Retina. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), (2020).
  47. Shang, P., et al. Chronic Alcohol Exposure Induces Aberrant Mitochondrial Morphology and Inhibits Respiratory Capacity in the Medial Prefrontal Cortex of Mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 561173 (2020).
  48. Pfeifer, C. R., et al. Quantitative analysis of mouse pancreatic islet architecture by serial block-face SEM. Journal of Structural Biology. 189 (1), 44-52 (2015).
  49. Wilke, S. A., et al. Deconstructing complexity: serial block-face electron microscopic analysis of the hippocampal mossy fiber synapse. Journal of Neuroscience. 33 (2), 507-522 (2013).
  50. Cocks, E., Taggart, M., Rind, F. C., White, K. A guide to analysis and reconstruction of serial block face scanning electron microscopy data. Journal of Microscopy. 270 (2), 217-234 (2018).
  51. Borrett, S., Hughes, L. Reporting methods for processing and analysis of data from serial block face scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 263 (1), 3-9 (2016).
  52. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  53. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  54. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, 52-61 (2005).
  55. Pidhorskyi, S., Morehead, M., Jones, Q., Spirou, G., Doretto, G. syGlass: interactive exploration of multidimensional images using virtual reality Head-mounted displays. arXiv . , (2018).
  56. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).
  57. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
  58. Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-Region Volume Segmentation workbench. Journal of Structural Biology. 198 (1), 43-53 (2017).
  59. Anderson, H. R., Stitt, A. W., Gardiner, T. A., Archer, D. B. Estimation of the surface area and volume of the retinal capillary basement membrane using the stereologic method of vertical sections. Analytical & Quantitative Cytology & Histology. 16 (4), 253-260 (1994).
  60. Gibbons, C. H., Illigens, B. M., Wang, N., Freeman, R. Quantification of sweat gland innervation: a clinical-pathologic correlation. Neurology. 72 (17), 1479-1486 (2009).
  61. Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs. Anat Rec. 292 (1), 113-122 (2009).
  62. Mahon, G. J., et al. Chloroquine causes lysosomal dysfunction in neural retina and RPE: implications for retinopathy. Current Eye Research. 28 (4), 277-284 (2004).
  63. Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area. Journal of Microscopy. 150, 117-136 (1988).
  64. Weibel, E. R. Stereological methods in cell biology: where are we–where are we going. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (9), 1043-1052 (1981).
  65. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. 신경과학. 130 (4), 813-831 (2005).
  66. Kristiansen, S. L., Nyengaard, J. R. Digital stereology in neuropathology. Apmis. 120 (4), 327-340 (2012).
  67. Howard, C. V., Reed, M. G. . Unbiased Stereology. 2nd edn. , (2005).
  68. Reith, A., Mayhew, T. M. . Stereology and Morphometry in Electron Microscopy: Problems and Solutions. , (1988).
  69. Mouton, P. R. . Principles and practices of unbiased stereology: an introduction for bioscientists. , (2002).

Tags

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM)Heavy Metal StainingResin InfiltrationAutomated Image Capture

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Courson, J. A., Landry, P. T., Do, T., Spehlmann, E., Lafontant, P. J., Patel, N., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples. J. Vis. Exp. (169), e62045, doi:10.3791/62045 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image