Microscopie électronique à balayage par blocs série (SBF-SEM) d’échantillons de tissus biologiques

Summary

Ce protocole décrit une méthode de routine pour l’utilisation de la microscopie électronique à balayage de bloc-face série (SBF-SEM), une technique d’imagerie 3D puissante. L’application réussie de SBF-SEM s’articule sur la fixation appropriée et les techniques de souillure de tissu, aussi bien que l’examen soigneux des arrangements de formation image. Ce protocole contient des considérations pratiques pour l’ensemble de ce processus.

Abstract

La microscopie électronique à balayage de bloc-face série (SBF-SEM) permet la collecte de centaines à des milliers d’images d’ultrastructure série-enregistrées, offrant une vue tridimensionnelle sans précédent de la microanatomie de tissu. Tandis que SBF-SEM a vu une augmentation exponentielle de l’utilisation ces dernières années, les aspects techniques tels que la préparation appropriée de tissu et les paramètres d’imagerie sont primordiaux pour le succès de cette modalité d’imagerie. Ce système d’imagerie bénéficie de la nature automatisée de l’appareil, permettant de laisser le microscope sans surveillance pendant le processus d’imagerie, avec la collecte automatisée de centaines d’images possible en une seule journée. Cependant, sans préparation tissulaire appropriée, l’ultrastructure cellulaire peut être modifiée de telle sorte que des conclusions incorrectes ou trompeuses puissent être tirées. De plus, les images sont générées en scannant la face d’îlot d’un échantillon biologique incorporé dans la résine, ce qui présente souvent des défis et des considérations qui doivent être abordés. L’accumulation d’électrons dans le bloc pendant l’imagerie, connue sous le nom de « charge tissulaire », peut entraîner une perte de contraste et une incapacité à apprécier la structure cellulaire. De plus, bien que l’augmentation de l’intensité/tension du faisceau d’électrons ou la diminution de la vitesse de balayage du faisceau puisse augmenter la résolution de l’image, cela peut également avoir l’effet secondaire malheureux d’endommager le bloc de résine et de déformer les images suivantes dans la série d’imagerie. Ici, nous présentons un protocole de routine pour la préparation d’échantillons de tissus biologiques qui préserve l’ultrastructure cellulaire et diminue la charge tissulaire. Nous fournissons également des considérations d’imagerie pour l’acquisition rapide d’images série de haute qualité avec des dommages minimaux au bloc tissulaire.

Introduction

La microscopie électronique à balayage de face de bloc série (SBF-SEM) a été décrite pour la première fois par Leighton en 1981 où il a façonné un microscope électronique à balayage augmenté d’un microtome intégré qui pourrait couper et imager de fines sections de tissu incorporées dans la résine. Malheureusement, des limitations techniques ont limité son utilisation aux échantillons conducteurs, car les échantillons non conducteurs tels que les tissus biologiques accumulaient des niveaux inacceptables de charge (accumulation d’électrons dans l’échantillon tissulaire)¹. Bien que le revêtement de la face de bloc entre les coupures avec une charge tissulaire réduite en carbone évaporé ait considérablement augmenté, cela a considérablement augmenté le temps d’acquisition d’images et le stockage d’images est resté un problème car la technologie informatique à l’époque était insuffisante pour gérer les grandes tailles de fichiers créées par l’appareil. Cette méthodologie a été revisitée par Denk et Horstmann en 2004 à l’aide d’un SBF-SEM équipé d’une chambre à pression variable^2. Cela a permis l’introduction de vapeur d’eau dans la chambre d’imagerie, ce qui réduit la charge dans l’échantillon, rendant l’imagerie des échantillons non conducteurs viable, bien qu’avec une perte de résolution d’image. D’autres améliorations dans la préparation des tissus et les méthodes d’imagerie permettent maintenant l’imagerie à l’aide du vide élevé, et l’imagerie SBF-SEM ne repose plus sur la vapeur d’eau pour dissiper la charge^{3,4,5,6,7,8,9.} Tandis que SBF-SEM a vu une augmentation exponentielle de l’utilisation ces dernières années, les aspects techniques tels que la préparation appropriée de tissu et les paramètres d’imagerie sont primordiaux pour le succès de cette modalité d’imagerie.

SBF-SEM permet la collecte automatisée de milliers d’images de microscopie électronique enregistrées en série, avec une résolution plane aussi petite que 3-5 nm^10,11. Les tissus, imprégnés de métaux lourds et incorporés dans de la résine, sont placés dans un microscope électronique à balayage (MEB) contenant un ultramicrotome muni d’un couteau à diamant. Une surface plane est coupée avec le couteau diamant, le couteau est rétracté et la surface du bloc est scannée dans un motif raster avec un faisceau d’électrons pour créer une image de l’ultrastructure tissulaire. Le bloc est ensuite soulevé une quantité spécifiée (par exemple, 100 nm) dans l’axe z, connu sous le nom de « z-step », et une nouvelle surface est coupée avant que le processus ne soit répété. De cette façon, un bloc d’images en 3 dimensions (3D) est produit lorsque le tissu est coupé. Ce système d’imagerie bénéficie en outre de la nature automatisée de l’appareil, permettant de laisser le microscope sans surveillance pendant le processus d’imagerie, avec la collecte automatisée de centaines d’images possible en une seule journée.

Alors que l’imagerie SBF-SEM utilise principalement des électrons rétrodiffusés pour former une image de la face de bloc, des électrons secondaires sont générés au cours du processus d’imagerie^12. Les électrons secondaires peuvent s’accumuler, aux côtés des électrons rétrodiffusés et à faisceau primaire qui ne s’échappent pas du bloc, et produire une « charge tissulaire », ce qui peut conduire à un champ électrostatique localisé au niveau de la face du bloc. Cette accumulation d’électrons peut déformer l’image ou provoquer l’éjection d’électrons du bloc et contribuer au signal collecté par le détecteur de rétrodiffusion, diminuant ainsi le rapport signal/bruit^13. Alors que le niveau de charge tissulaire peut être diminué en réduisant la tension ou l’intensité du faisceau d’électrons, ou en réduisant le temps d’arrêt du faisceau, il en résulte une diminution du rapport signal sur bruit^{de 14.} Lorsqu’un faisceau d’électrons de tension ou d’intensité inférieure est utilisé, ou que le faisceau n’est autorisé à demeurer dans chaque espace de pixel que pendant une période plus courte, moins d’électrons rétrodiffusés sont éjectés du tissu et capturés par le détecteur d’électrons, ce qui entraîne un signal plus faible. Denk et Horstmann ont résolu ce problème en introduisant de la vapeur d’eau dans la chambre, réduisant ainsi la charge dans la chambre et sur la face de bloc au détriment de la résolution d’image. Avec une pression de chambre de 10-100 Pa, une partie du faisceau d’électrons est diffusée contribuant au bruit de l’image et à une perte de résolution, mais cela produit également des ions dans la chambre d’éprouvette qui neutralise la charge à l’intérieur du bloc d’échantillon^2. Des méthodes plus récentes pour neutraliser la charge dans le bloc d’échantillon utilisent l’injection focale de gaz d’azote sur la face du bloc lors de l’imagerie, ou l’introduction d’une tension négative à l’étage SBF-SEM pour diminuer l’énergie de la sonde-faisceau-ladage et augmenter le signal collecté^6,7,15. Plutôt que d’introduire un biais d’étape, une pression de chambre ou une injection localisée d’azote pour diminuer l’accumulation de charge sur la surface du bloc, il est également possible d’augmenter la conductivité de la résine en introduisant du carbone dans le mélange de résine permettant des réglages d’imagerie plus agressifs^16. Le protocole général suivant est une adaptation du protocole de Deerinck et al. publié en 2010 et couvre les modifications apportées aux méthodologies de préparation et d’imagerie des tissus que nous avons trouvées utiles pour minimiser la charge tissulaire tout en maintenant l’acquisition d’images à haute résolution^3,17,18,19. Tandis que le protocole mentionné précédemment s’est concentré sur le traitement de tissu et l’imprégnation de métaux lourds, ce protocole fournit un aperçu dans l’imagerie, l’analyse de données, et le flux de travail de reconstruction inhérent aux études de SBF-SEM. Dans notre laboratoire, ce protocole a été appliqué avec succès et reproductiblement à une grande variété de tissus, y compris la cornée et les structures du segment antérieur, la paupière, la glande lacrymale et plus dure, la rétine et le nerf optique, le cœur, le poumon et les voies respiratoires, les reins, le foie, le muscle crémaster et le cortex cérébral / médulle, et dans une variété d’espèces, y compris la souris, le rat, le lapin, le cobaye, le poisson, la monocouche et les cultures cellulaires stratifiées, le porc, le primate non humain, ainsi que l’homme^20,21,22,23. Bien que de petits changements puissent être utiles pour des tissus et des applications spécifiques, ce protocole général s’est avéré hautement reproductible et utile dans le contexte de notre installation d’imagerie de base.

Protocol

Tous les animaux ont été manipulés conformément aux lignes directrices décrites dans la Déclaration d’utilisation d’animaux dans la recherche sur la vision et l’ophtalmologie de l’Association for Research in Vision and Ophthalmic Research et dans les lignes directrices sur la manipulation des animaux du College of Optometry de l’Université de Houston. Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par les établissements dans lesquels elles ont été manipulées : les procédures rela…

Representative Results

Cornée de sourisCe protocole a été largement appliqué à la cornée de souris. Utilisant la formation image de SBF-SEM un réseau des paquets sans élastine de microfibrille (EFMBs) se sont avérés présents dans la cornée adulte de souris. On croyait auparavant que ce réseau n’était présent que pendant le développement embryonnaire et postnatal précoce. SBF-SEM a indiqué un réseau étendu d’EFMB dans toute la cornée, avec les différentes fibres avérées pour être 100-200 nanomè…

Discussion

Le but de cet article de méthodes est de mettre en évidence la méthodologie de préparation et d’imagerie des tissus qui a permis à notre laboratoire de capturer de manière fiable des images de microscopie électronique série à haute résolution, et de souligner les étapes critiques qui mènent à ce résultat ainsi que les pièges potentiels qui peuvent survenir lors de la réalisation de l’imagerie SBF-SEM. Le succès de l’utilisation de ce protocole nécessite une fixation appropriée des tissus, l’imp…

Materials

1/16 x 3/8 Aluminum Rivets	Industrial Rivet & Fastener Co.	6N37RFLAP/1100	Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver	Wiha Quality Tools	27225
Acetone	Electron Microscopy Sciences	RT 10000	Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid	Sigma-Aldrich	A8949
Calcium Chloride	FisherScientific	C79-500
Conductive Silver Paint	Ted Pella	16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target	Denton Vacuum	N/A	This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors	Fisher Scientific	50-949-411
Embed 812	Electron Microscopy Sciences	14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM	Gatan & Tescan	N/A	This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml)	Electron Microscopy Sciences	72630-05
Gluteraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16320
Gorilla Super Glue – Impact Tough	NA	NA	Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black	HM Royal	EC-600JD	Refered to as carbon black in text.
KOH	FisherScientific	18-605-593
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L62-100
Microwave	Pelco	BioWave Pro	This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide	Sigma-Aldrich	201030
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P9387
Silicone Embedding Mold	Ted Pella	10504
Sodium Cacodylate Trihydrate	Electron Microscopy Sciences	12300
Samco Transfer Pipette	ThermoFisher Scientific	202	Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files	Electron Microscopy Sciences	62115
Thiocarbohydrazide	Sigma-Aldrich	223220
Uranyl Acetate	Polysciences, Inc.	21447-25
Reconstruction Software
Amira Software	Thermo Scientific	N/A	Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ)	ImageJ.net	N/A	TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB)	University of Helsinki, Institute of Biotechnology	N/A
Reconstuct Software	Neural Systems Lab	N/A
SuRVoS Workbench	Diamond Light Source & The University of Nottingham	N/A
SyGlass	IstoVisio, Inc.	N/A	Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.