जैविक ऊतक नमूनों के सीरियल ब्लॉक-फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसबीएफ-एसईएम)
Summary
यह प्रोटोकॉल सीरियल ब्लॉक-फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसबीएफ-एसईएम), एक शक्तिशाली 3 डी इमेजिंग तकनीक का उपयोग करने के लिए एक नियमित विधि को रेखांकित करता है। एसबीएफ-एसईएम का सफल अनुप्रयोग उचित निर्धारण और ऊतक धुंधला तकनीकों पर टिका है, साथ ही इमेजिंग सेटिंग्स पर सावधानीपूर्वक विचार करना। इस प्रोटोकॉल में इस प्रक्रिया की संपूर्णता के लिए व्यावहारिक विचार शामिल हैं।
Abstract
धारावाहिक ब्लॉक-फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसबीएफ-एसईएम) सैकड़ों से हजारों धारावाहिक-पंजीकृत अल्ट्रास्ट्रक्चरल छवियों के संग्रह के लिए अनुमति देता है, जो ऊतक माइक्रोएनाटॉमी के अभूतपूर्व त्रि-आयामी दृश्य की पेशकश करता है। जबकि एसबीएफ-एसईएम ने हाल के वर्षों में उपयोग में घातीय वृद्धि देखी है, इस इमेजिंग मोडलि14 की सफलता के लिए उचित ऊतक तैयारी और इमेजिंग पैरामीटर जैसे तकनीकी पहलू सर्वोपरि हैं। यह इमेजिंग सिस्टम डिवाइस की स्वचालित प्रकृति से लाभान्वित होता है, जिससे एक ही दिन में सैकड़ों छवियों के स्वचालित संग्रह के साथ इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान माइक्रोस्कोप को उपेक्षित छोड़ने की अनुमति होती है। हालांकि, उचित ऊतक तैयारी के बिना सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर को इस तरह से बदला जा सकता है कि गलत या भ्रामक निष्कर्ष निकाले जा सकते हैं। इसके अतिरिक्त, छवियों को राल-एम्बेडेड जैविक नमूने के ब्लॉक-फेस को स्कैन करके उत्पन्न किया जाता है और यह अक्सर चुनौतियों और विचारों को प्रस्तुत करता है जिन्हें संबोधित किया जाना चाहिए। इमेजिंग के दौरान ब्लॉक के भीतर इलेक्ट्रॉनों का संचय, जिसे “ऊतक चार्जिंग” के रूप में जाना जाता है, इसके विपरीत नुकसान और सेलुलर संरचना की सराहना करने में असमर्थता का कारण बन सकता है। इसके अलावा, जबकि इलेक्ट्रॉन बीम तीव्रता बढ़ाने/वोल्टेज या बीम स्कैनिंग गति कम छवि संकल्प में वृद्धि कर सकते हैं, यह भी राल ब्लॉक को नुकसान पहुंचाने और इमेजिंग श्रृंखला में बाद की छवियों को विकृत करने का दुर्भाग्यपूर्ण दुष्प्रभाव हो सकता है । यहां हम जैविक ऊतक नमूनों की तैयारी के लिए एक नियमित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर को संरक्षित करता है और ऊतक चार्जिंग को कम करता है। हम ऊतक ब्लॉक को न्यूनतम क्षति के साथ उच्च गुणवत्ता वाले धारावाहिक-छवियों के तेजी से अधिग्रहण के लिए इमेजिंग विचार भी प्रदान करते हैं।
Introduction
सीरियल ब्लॉक फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसबीएफ-एसईएम) को पहली बार १९८१ में Leighton द्वारा वर्णित किया गया था, जहां उन्होंने एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप को एक इन-बिल्ट माइक्रोटॉम के साथ संवर्धित किया था जो राल में एम्बेडेड ऊतकों के पतले वर्गों को काट सकता है और छवि सकता है । दुर्भाग्य से, तकनीकी सीमाओं प्रवाहकीय नमूनों के लिए इसके उपयोग को प्रतिबंधित, जैसे जैविक ऊतक के रूप में गैर-प्रवाहकीय नमूने चार्जिंग (ऊतक नमूने के भीतर इलेक्ट्रॉन बिल्डअप)1के अस्वीकार्य स्तर जमा होते हैं। जबकि सुखाया कार्बन कम ऊतक चार्ज के साथ कटौती के बीच ब्लॉक-चेहरा कोटिंग, यह बहुत बढ़ी इमेजिंग अधिग्रहण समय और छवि भंडारण के रूप में एक समस्या बनी रही के रूप में समय पर कंप्यूटर प्रौद्योगिकी के लिए बड़ी फ़ाइल डिवाइस द्वारा बनाई गई आकार का प्रबंधन अपर्याप्त था । इस पद्धति को 2004 में डेंक और हॉर्स्टमैन द्वारा एक परिवर्तनीय दबाव कक्ष2से लैस एसबीएफ-एसईएम का उपयोग करके फिर से गौर किया गया था। यह इमेजिंग कक्ष जो नमूने के भीतर चार्ज कम कर देता है करने के लिए पानी वाष्प की शुरूआत के लिए अनुमति दी, गैर प्रवाहकीय नमूनों की इमेजिंग बनाने हालांकि छवि संकल्प की हानि के साथ व्यवहार्य । ऊतक तैयार करने और इमेजिंग विधियों में और सुधार अब उच्च वैक्यूम का उपयोग करके इमेजिंग की अनुमति देते हैं, और एसबीएफ-एसईएम इमेजिंग अब3,4, 5,6,7,8,9को नष्ट करने के लिए जल वाष्प पर निर्भर नहीं करता है। जबकि एसबीएफ-एसईएम ने हाल के वर्षों में उपयोग में घातीय वृद्धि देखी है, इस इमेजिंग मोडलि14 की सफलता के लिए उचित ऊतक तैयारी और इमेजिंग पैरामीटर जैसे तकनीकी पहलू सर्वोपरि हैं।
एसबीएफ-एसईएम हजारों सीरियल-पंजीकृत इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों के स्वचालित संग्रह के लिए अनुमति देता है, जिसमें प्लानर संकल्प 3-5 एनएम10,11के रूप में छोटा है। ऊतक, भारी धातुओं के साथ गर्भवती और राल में एम्बेडेड, एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (एसईएम) के भीतर रखा जाता है जिसमें हीरे के चाकू से लगे अल्ट्रामाइक्रोटोम होते हैं। एक सपाट सतह हीरे के चाकू से काटी जाती है, चाकू मुकर जाता है, और ब्लॉक की सतह को ऊतक अल्ट्रास्ट्रक्चर की छवि बनाने के लिए इलेक्ट्रॉन बीम के साथ एक रैस्टर पैटर्न में स्कैन किया जाता है। ब्लॉक तो जेड-धुरी, एक “जेड कदम के रूप में जाना जाता है में एक निर्दिष्ट राशि (जैसे, १०० एनएम) उठाया है, और एक नई सतह कटौती से पहले प्रक्रिया दोहराया है । इस तरह ऊतक को काटते ही छवियों का 3-आयामी (3डी) ब्लॉक तैयार किया जाता है। यह इमेजिंग सिस्टम डिवाइस की स्वचालित प्रकृति से आगे लाभ उठाता है, जिससे एक ही दिन में सैकड़ों छवियों के स्वचालित संग्रह के साथ इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान माइक्रोस्कोप को उपेक्षित छोड़ने की अनुमति देता है।
जबकि एसबीएफ-एसईएम इमेजिंग मुख्य रूप से ब्लॉक-फेस की छवि बनाने के लिए बैकस्कैटर इलेक्ट्रॉनों का उपयोग करता है, इमेजिंग प्रक्रिया12के दौरान माध्यमिक इलेक्ट्रॉन उत्पन्न होते हैं। माध्यमिक इलेक्ट्रॉन बैकस्कैटर और प्राथमिक-बीम इलेक्ट्रॉनों के साथ जमा हो सकते हैं जो ब्लॉक से बच नहीं पाते हैं, और “ऊतक चार्जिंग” का उत्पादन करते हैं, जो ब्लॉक-फेस पर स्थानीयकृत इलेक्ट्रोस्टैटिक क्षेत्र का कारण बन सकता है। यह इलेक्ट्रॉन संचय छवि को विकृत कर सकता है या इलेक्ट्रॉनों को ब्लॉक से बाहर निकाल सकता है और बैकस्कैटर डिटेक्टर द्वारा एकत्र किए गए सिग्नल में योगदान दे सकता है, जिससे सिग्नल-टू-शोर अनुपात13कम हो जाता है। जबकि ऊतक चार्जिंग के स्तर को इलेक्ट्रॉन बीम वोल्टेज या तीव्रता को कम करके कम किया जा सकता है, या बीम निवास समय को कम कर सकता है, इसके परिणामस्वरूप सिग्नल-टू-शोर अनुपात14कम हो जाता है। जब कम वोल्टेज या तीव्रता के इलेक्ट्रॉन बीम का उपयोग किया जाता है, या बीम को केवल कम अवधि के लिए प्रत्येक पिक्सेल अंतरिक्ष के भीतर रहने की अनुमति दी जाती है, तो ऊतक से कम बैकस्कैटर इलेक्ट्रॉनों को बाहर निकाला जाता है और इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर द्वारा कब्जा कर लिया जाता है जिसके परिणामस्वरूप एक कमजोर संकेत होता है। Denk और Horstmann चैंबर में पानी वाष्प शुरू करने से इस समस्या से निपटा, जिससे चैंबर में प्रभारी को कम करने और छवि संकल्प की कीमत पर ब्लॉक चेहरे पर । 10-100 पीए के एक कक्ष दबाव के साथ, इलेक्ट्रॉन बीम का एक हिस्सा छवि शोर और संकल्प की हानि में योगदान देता है, हालांकि यह नमूना कक्ष में आयनों का उत्पादन करता है जो नमूना ब्लॉक2के भीतर चार्ज को बेअसर करता है। नमूना ब्लॉक के भीतर चार्ज बेअसर करने के लिए हाल के तरीकों इमेजिंग के दौरान ब्लॉक-फेस पर नाइट्रोजन के फोकल गैस इंजेक्शन का उपयोग करें, या जांच-बीम-लदान ऊर्जा को कम करनेऔर6,7,15एकत्र किए गए सिग्नल को बढ़ाने के लिए एसबीएफ-एसईएम चरण में नकारात्मक वोल्टेज शुरू करें। ब्लॉक सतह पर चार्ज बिल्डअप को कम करने के लिए चरण पूर्वाग्रह, कक्ष दबाव या स्थानीयकृत नाइट्रोजन इंजेक्शन शुरू करने के बजाय, राल मिश्रण में कार्बन शुरू करके राल की चालकता को बढ़ाना भी संभव है, जो अधिक आक्रामक इमेजिंग सेटिंग्स16के लिए अनुमति देता है। निम्नलिखित सामान्य प्रोटोकॉल 2010 में प्रकाशित डियरिंक एट अल प्रोटोकॉल का अनुकूलन है और इसमें ऊतक ों की तैयारी और इमेजिंग पद्धतियों में संशोधन शामिल हैं जो हमने उच्च संकल्प छवि अधिग्रहण 3 , 17 , 18,19कोबनाए रखते हुए ऊतकचार्जिंगको कम करने के लिए उपयोगी पाया। जबकि ऊतक प्रसंस्करण और भारी धातु गर्भवती पर ध्यान केंद्रित पहले उल्लिखित प्रोटोकॉल, यह प्रोटोकॉल इमेजिंग, डेटा विश्लेषण और पुनर्निर्माण कार्यप्रवाह एसबीएफ-एसईएम अध्ययनों में निहित अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। हमारी प्रयोगशाला में, इस प्रोटोकॉल को कॉर्निया और पूर्वकाल खंड संरचनाओं सहित विभिन्न ऊतकों पर सफलतापूर्वक और पुन: लागू किया गया है, पलक, लैक्रिमल और कठिन ग्रंथि, रेटिना और ऑप्टिक तंत्रिका, दिल, फेफड़े और वायुमार्ग, गुर्दे, जिगर, क्रेमास्टर मांसपेशी, और सेरेब्रल कॉर्टेक्स/मेडुला, और माउस, चूहा, खरगोश, गिनी सुअर, मछली, मोनोलेयर और स्तरीकृत सेल संस्कृतियों, सुअर, गैर मानव रहनुमा, साथ ही मानव20,21,22,23सहित प्रजातियों की एक किस्म में । जबकि छोटे परिवर्तन विशिष्ट ऊतकों और अनुप्रयोगों के लिए सार्थक हो सकते हैं, यह सामान्य प्रोटोकॉल हमारे कोर इमेजिंग सुविधा के संदर्भ में अत्यधिक प्रजनन योग्य और उपयोगी साबित हुआ है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस तरीके कागज का उद्देश्य ऊतक तैयारी और इमेजिंग पद्धति है कि हमारी प्रयोगशाला मज़बूती से उच्च संकल्प धारावाहिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों पर कब्जा करने की अनुमति दी है पर प्रकाश डाला है, और महत?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ सैम हैलोन, एवलिन ब्राउन, और मार्गरेट गोंडो उनके उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) आर01 ईवाई-018239 और पी 30 EY007551 (राष्ट्रीय नेत्र संस्थान) द्वारा भाग में, लायन फाउंडेशन फॉर दृष्टि द्वारा और एनआईएच 1R15 एचडी084262-01 (राष्ट्रीय बाल स्वास्थ्य और मानव विकास संस्थान) द्वारा भाग में समर्थित किया गया था।
Materials
| 1/16 x 3/8 Aluminum Rivets | Industrial Rivet & Fastener Co. | 6N37RFLAP/1100 | Used as specimen pins. |
| 2.5mm Flathead Screwdriver | Wiha Quality Tools | 27225 | |
| Acetone | Electron Microscopy Sciences | RT 10000 | Used to dilute silver paint. |
| Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A8949 | |
| Calcium Chloride | FisherScientific | C79-500 | |
| Conductive Silver Paint | Ted Pella | 16062 | |
| Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target | Denton Vacuum | N/A | This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable. |
| Double-edged Razors | Fisher Scientific | 50-949-411 | |
| Embed 812 | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM | Gatan & Tescan | N/A | This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable. |
| Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml) | Electron Microscopy Sciences | 72630-05 | |
| Gluteraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
| Gorilla Super Glue – Impact Tough | NA | NA | Refered to as cyanoacrylate glue in text. |
| Ketjen Black | HM Royal | EC-600JD | Refered to as carbon black in text. |
| KOH | FisherScientific | 18-605-593 | |
| Lead Nitrate | Fisher Scientific | L62-100 | |
| Microwave | Pelco | BioWave Pro | This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable. |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 201030 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Silicone Embedding Mold | Ted Pella | 10504 | |
| Sodium Cacodylate Trihydrate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| Samco Transfer Pipette | ThermoFisher Scientific | 202 | Used to make specimen pin storage tubes. |
| Swiss Pattern Needle Files | Electron Microscopy Sciences | 62115 | |
| Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich | 223220 | |
| Uranyl Acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 | |
| Reconstruction Software | |||
| Amira Software | Thermo Scientific | N/A | Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9. |
| Fiji (Fiji is Just ImageJ) | ImageJ.net | N/A | TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation. |
| Microscopy Image Browser (MIB) | University of Helsinki, Institute of Biotechnology | N/A | |
| Reconstuct Software | Neural Systems Lab | N/A | |
| SuRVoS Workbench | Diamond Light Source & The University of Nottingham | N/A | |
| SyGlass | IstoVisio, Inc. | N/A | Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods. |
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