Microscopia elettronica seriale a scansione a blocchi (SBF-SEM) di campioni di tessuto biologico

Summary

Questo protocollo delinea un metodo di routine per l’utilizzo della microscopia elettronica seriale a scansione block-face (SBF-SEM), una potente tecnica di imaging 3D. L’applicazione di successo di SBF-SEM dipende da corrette tecniche di fissazione e colorazione dei tessuti, nonché da un’attenta considerazione delle impostazioni di imaging. Questo protocollo contiene considerazioni pratiche per l’intero processo.

Abstract

La microscopia elettronica seriale a scansione a blocchi (SBF-SEM) consente la raccolta da centinaia a migliaia di immagini ultrastrutturali registrate in serie, offrendo una visione tridimensionale senza precedenti della microanatomia tissutale. Mentre SBF-SEM ha visto un aumento esponenziale dell’uso negli ultimi anni, aspetti tecnici come una corretta preparazione dei tessuti e parametri di imaging sono fondamentali per il successo di questa modalità di imaging. Questo sistema di imaging beneficia della natura automatizzata del dispositivo, consentendo di lasciare il microscopio incustodito durante il processo di imaging, con la raccolta automatizzata di centinaia di immagini possibili in un solo giorno. Tuttavia, senza un’adeguata preparazione dei tessuti, l’ultrastruttura cellulare può essere modificata in modo tale da poter trarre conclusioni errate o fuorvianti. Inoltre, le immagini vengono generate scansionando la faccia a blocchi di un campione biologico incorporato nella resina e questo spesso presenta sfide e considerazioni che devono essere affrontate. L’accumulo di elettroni all’interno del blocco durante l’imaging, noto come “carica tissutale”, può portare a una perdita di contrasto e all’incapacità di apprezzare la struttura cellulare. Inoltre, mentre l’aumento dell’intensità/tensione del fascio di elettroni o la diminuzione della velocità di scansione del fascio possono aumentare la risoluzione dell’immagine, questo può anche avere lo sfortunato effetto collaterale di danneggiare il blocco di resina e distorcere le immagini successive nella serie di imaging. Qui presentiamo un protocollo di routine per la preparazione di campioni di tessuto biologico che preserva l’ultrastruttura cellulare e diminuisce la carica tissutale. Forniamo anche considerazioni di imaging per la rapida acquisizione di immagini seriali di alta qualità con danni minimi al blocco tissutale.

Introduction

La microscopia elettronica a scansione facciale a blocchi seriali (SBF-SEM) è stata descritta per la prima volta da Leighton nel 1981, dove ha modellato un microscopio elettronico a scansione potenziato con un microtomo incorporato in grado di tagliare e tagliare sottili sezioni di tessuto incorporate nella resina. Sfortunatamente, le limitazioni tecniche ne limitavano l’uso a campioni conduttivi, poiché campioni non conduttivi come il tessuto biologico accumulavano livelli inaccettabili di carica (accumulo di elettroni all’interno del campione di tessuto)¹. Mentre rivesteva il blocco-faccia tra i tagli con la ricarica dei tessuti ridotta al carbonio evaporato, questo aumentò notevolmente il tempo di acquisizione dell’imaging e la memorizzazione delle immagini rimase un problema poiché la tecnologia informatica all’epoca era insufficiente per gestire le grandi dimensioni dei file create dal dispositivo. Questa metodologia è stata rivisitata da Denk e Horstmann nel 2004 utilizzando uno SBF-SEM dotato di una camera a pressione^{variabile 2}. Ciò ha permesso l’introduzione del vapore acqueo nella camera di imaging che riduce la carica all’interno del campione, rendendo praticabile l’imaging di campioni non conduttivi anche se con una perdita di risoluzione dell’immagine. Ulteriori miglioramenti nella preparazione dei tessuti e nei metodi di imaging ora consentono l’imaging utilizzando un alto vuoto e l’imaging SBF-SEM non si basa più sul vapore acqueo per dissipare^{la carica 3,4,5,6,7,8,9}. Mentre SBF-SEM ha visto un aumento esponenziale dell’uso negli ultimi anni, aspetti tecnici come una corretta preparazione dei tessuti e parametri di imaging sono fondamentali per il successo di questa modalità di imaging.

SBF-SEM consente la raccolta automatizzata di migliaia di immagini di microscopia elettronica registrate in serie, con risoluzione planare fino a 3-5 nm^10,11. Il tessuto, impregnato di metalli pesanti e incorporato nella resina, è posto all’interno di un microscopio elettronico a scansione (SEM) contenente un ultramicrotoma dotato di coltello a diamante. Una superficie piana viene tagliata con il coltello a diamante, il coltello viene retratti e la superficie del blocco viene scansionata in un motivo raster con un fascio di elettroni per creare un’immagine di ultrastruttura tissutale. Il blocco viene quindi sollevato una quantità specificata (ad esempio, 100 nm) nell’asse Z, noto come “passo z”, e una nuova superficie viene tagliata prima che il processo si ripeta. In questo modo viene prodotto un blocco di immagini tridimensionale (3D) man mano che il tessuto viene tagliato. Questo sistema di imaging beneficia ulteriormente della natura automatizzata del dispositivo, consentendo di lasciare il microscopio incustodito durante il processo di imaging, con la raccolta automatizzata di centinaia di immagini possibili in un solo giorno.

Mentre l’imaging SBF-SEM utilizza principalmente elettroni retroscatterati per formare un’immagine della faccia del blocco, gli elettroni secondari vengono generati durante il processo di imaging¹². Gli elettroni secondari possono accumularsi, insieme agli elettroni retroscatterati e a fascio primario che non sfuggono al blocco, e produrre “carica tissutale”, che può portare a un campo elettrostatico localizzato nella faccia del blocco. Questo accumulo di elettroni può distorcere l’immagine o causare l’espulsa di elettroni dal blocco e contribuire al segnale raccolto dal rivelatore backscatter, diminuendo il rapporto segnale-rumore¹³. Mentre il livello di carica tissutale può essere diminuito riducendo la tensione o l’intensità del fascio di elettroni o riducendo il tempo di divaggio del fascio, ciò si traduce in un rapporto segnale-rumore^{ridotto 14}. Quando si utilizza un fascio di elettroni di tensione o intensità inferiore, o il fascio può abitare all’interno di ogni spazio di pixel solo per un periodo di tempo più breve, meno elettroni retroscatterati vengono espulsi dal tessuto e catturati dal rivelatore di elettroni con conseguente segnale più debole. Denk e Horstmann affrontavano questo problema introducendo vapore acqueo nella camera, riducendo così la carica nella camera e sulla faccia del blocco a costo della risoluzione dell’immagine. Con una pressione della camera di 10-100 Pa, una porzione del fascio di elettroni è sparsa contribuendo al rumore dell’immagine e alla perdita di risoluzione, tuttavia questo produce anche ioni nella camera del campione che neutralizza la carica all’interno del blocco^{campione 2}. Metodi più recenti per neutralizzare la carica all’interno del blocco campione utilizzano l’iniezione focale di gas di azoto sulla faccia del blocco durante l’imaging, o introducendo tensione negativa allo stadio SBF-SEM per ridurre l’energia di carico sonda-fascio e aumentare il^{segnale raccolto 6,7,15}. Piuttosto che introdurre distorsioni dello stadio, pressione della camera o iniezione di azoto localizzata per ridurre l’accumulo di carica sulla superficie del blocco, è anche possibile aumentare la conducibilità della resina introducendo carbonio nella miscela di resina consentendo impostazioni di imaging più aggressive¹⁶. Il seguente protocollo generale è un adattamento del protocollo Deerinck et al. Mentre il protocollo precedentemente menzionato si concentrava sull’elaborazione dei tessuti e sull’impregnazione di metalli pesanti, questo protocollo fornisce informazioni sul flusso di lavoro di imaging, analisi dei dati e ricostruzione inerente agli studi SBF-SEM. Nel nostro laboratorio, questo protocollo è stato applicato con successo e riproducibile a un’ampia varietà di tessuti tra cui cornea e strutture del segmento anteriore, palpebra, ghiandola lacrimale e harderiana, retina e nervo ottico, cuore, polmone e vie aeree, rene, fegato, muscolo cremastere e corteccia cerebrale / midollo, e in una varietà di specie tra cui topo, ratto, coniglio, porcellino d’India, pesce, monostrato e colture cellulari stratificate, maiale, primate non umano,^{nonché umano 20,21,22,23}. Sebbene piccoli cambiamenti possano essere utili per tessuti e applicazioni specifici, questo protocollo generale si è dimostrato altamente riproducibile e utile nel contesto della nostra struttura di imaging di base.

Protocol

Tutti gli animali sono stati trattati secondo le linee guida descritte nella Dichiarazione dell’Association for Research in Vision and Ofthalmology per l’uso degli animali nella ricerca sulla vista e sugli oftalmici e nelle linee guida per la manipolazione animale dell’University of Houston College of Optometry. Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dalle istituzioni in cui sono state gestite: le procedure per topi, ratti, conigli, cavie e primati non umani sono state approvate dal Comitato per la cura …

Representative Results

Cornea di topoQuesto protocollo è stato ampiamente applicato alla cornea di topo. Utilizzando l’imaging SBF-SEM, è stata dimostrata la soddisfazione di una rete di fasci di microfibrille senza elastina (EF PCB) all’interno della cornea di topo adulta. In precedenza si credeva che questa rete fosse presente solo durante lo sviluppo embrionale e postnatale precoce. SBF-SEM ha rivelato una vasta rete EFMB in tutta la cornea, con fibre individuali che hanno un diametro di 100-200 nm se misurate in sezi…

Discussion

Lo scopo di questo documento sui metodi è quello di evidenziare la metodologia di preparazione e imaging dei tessuti che ha permesso al nostro laboratorio di catturare in modo affidabile immagini di microscopia elettronica seriale ad alta risoluzione e di evidenziare i passaggi critici che portano a questo risultato e potenziali insidie che possono verificarsi durante la conduzione dell’imaging SBF-SEM. Il successo nell’utilizzo di questo protocollo richiede una corretta fissazione dei tessuti, l’impregnazione di metall…

Materials

1/16 x 3/8 Aluminum Rivets	Industrial Rivet & Fastener Co.	6N37RFLAP/1100	Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver	Wiha Quality Tools	27225
Acetone	Electron Microscopy Sciences	RT 10000	Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid	Sigma-Aldrich	A8949
Calcium Chloride	FisherScientific	C79-500
Conductive Silver Paint	Ted Pella	16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target	Denton Vacuum	N/A	This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors	Fisher Scientific	50-949-411
Embed 812	Electron Microscopy Sciences	14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM	Gatan & Tescan	N/A	This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml)	Electron Microscopy Sciences	72630-05
Gluteraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16320
Gorilla Super Glue – Impact Tough	NA	NA	Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black	HM Royal	EC-600JD	Refered to as carbon black in text.
KOH	FisherScientific	18-605-593
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L62-100
Microwave	Pelco	BioWave Pro	This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide	Sigma-Aldrich	201030
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P9387
Silicone Embedding Mold	Ted Pella	10504
Sodium Cacodylate Trihydrate	Electron Microscopy Sciences	12300
Samco Transfer Pipette	ThermoFisher Scientific	202	Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files	Electron Microscopy Sciences	62115
Thiocarbohydrazide	Sigma-Aldrich	223220
Uranyl Acetate	Polysciences, Inc.	21447-25
Reconstruction Software
Amira Software	Thermo Scientific	N/A	Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ)	ImageJ.net	N/A	TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB)	University of Helsinki, Institute of Biotechnology	N/A
Reconstuct Software	Neural Systems Lab	N/A
SuRVoS Workbench	Diamond Light Source & The University of Nottingham	N/A
SyGlass	IstoVisio, Inc.	N/A	Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.