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생물학

생물학적 조직 샘플의 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBF-SEM)

Published: March 26, 2021
doi:
10.3791/62045
, , , , , , ,
1College of Optometry,University of Houston, 2Department of Biology,DePauw University, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID),Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 4Children’s Nutrition Center,Baylor College of Medicine

Summary

이 프로토콜은 강력한 3D 이미징 기술인 직렬 블록-페이스 스캐닝 전자 현미경 검사(SBF-SEM)를 사용하는 일상적인 방법을 간략하게 설명합니다. SBF-SEM의 성공적인 적용은 적절한 고정 및 조직 염색 기술뿐만 아니라 이미징 설정을 신중하게 고려합니다. 이 프로토콜에는 이 프로세스 전체에 대한 실용적인 고려 사항이 포함되어 있습니다.

Abstract

직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBF-SEM)는 수백~수천 개의 연속 등록 초구조 이미지를 수집하여 조직 미세 해부학의 전례 없는 3차원 뷰를 제공합니다. SBF-SEM은 최근 몇 년 동안 사용이 기하급수적으로 증가하는 반면, 적절한 조직 준비 및 이미징 매개 변수와 같은 기술적 측면은 이 이미징 양식의 성공을 위해 가장 중요합니다. 이 이미징 시스템은 장치의 자동화된 특성의 이점을 통해 이미징 프로세스 중에 현미경을 방치하고 하루에 수백 개의 이미지를 자동화하여 수집할 수 있습니다. 그러나, 적절 한 조직 준비 없이 세포 울트라 구조 잘못 되 거나 오해의 소지가 결론 그려질 수 있습니다 같은 방식으로 변경할 수 있습니다. 또한 수지 임베디드 생물학적 샘플의 블록 페이스를 스캔하여 이미지가 생성되며, 이는 종종 해결해야 할 과제와 고려 사항을 제시합니다. “조직 충전”으로 알려진 이미징 중 블록 내의 전자가 축적되면 대비가 상실되고 세포 구조를 감상할 수 없습니다. 더욱이, 전자 빔 강도/전압을 증가하거나 빔 스캐닝 속도가 감소하면 이미지 해상도를 높일 수 있지만, 이는 또한 수지 블록을 손상시키고 이미징 시리즈에서 후속 이미지를 왜곡하는 불행한 부작용을 가질 수 있다. 여기서 우리는 세포 초구조를 보존하고 조직 충전을 감소시키는 생물학적 조직 샘플의 준비를 위한 일상적인 프로토콜을 제시합니다. 또한 티슈 블록에 최소한의 손상을 입히면서 고품질 의 시리얼 이미지를 빠르게 획득하기 위한 이미징 고려 사항을 제공합니다.

Introduction

직렬 블록 얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사 (SBF-SEM)는 1981 년 레이튼에 의해 처음 설명되었으며 수지에 내장 된 조직의 얇은 섹션을 절단하고 이미지 할 수있는 내장 된 마이크로 토메로 보강 된 스캐닝 전자 현미경을 만들었습니다. 불행하게도, 기술적 제한은 생물학적 조직과 같은 비전도성 샘플이 허용 할 수없는 수준의 충전 (조직 샘플 내의 전자 축적)을 축적함에 따라 전도성 샘플에 의한 사용을제한하였다. 증발된 탄소 감소 조직 충전으로 컷 사이에 블록 페이스를 코팅하는 동안, 이 크게 증가된 이미징 수집 시간과 이미지 저장은 당시 컴퓨터 기술이 장치에 의해 생성된 큰 파일 크기를 관리하기에 충분하지 못했기 때문에 문제가 남아 있었다. 이 방법론은 2004년 덴크와 호르스트만이 가변 압력 챔버2를장착한 SBF-SEM을 사용하여 재검토되었다. 이를 통해 시료 내의 충전을 줄이는 이미징 챔버에 수증기를 도입하여 이미지 해상도의 손실에도 불구하고 비전도성 시료의 이미징을 실현할 수 있었습니다. 조직 제제 및 이미징 방법의 추가 개선은 이제 높은 진공을 사용하여 이미징을 허용하고, SBF-SEM 이미징은 더 이상 충전3,4,5,6,7,8,9를방출하기 위해 수증기에 의존하지 않는다. SBF-SEM은 최근 몇 년 동안 사용이 기하급수적으로 증가하는 반면, 적절한 조직 준비 및 이미징 매개 변수와 같은 기술적 측면은 이 이미징 양식의 성공을 위해 가장 중요합니다.

SBF-SEM은 3-5 nm10,11의작은 평면 해상도로 수천 개의 연속 등록 전자 현미경 이미지의 자동화 된 컬렉션을 허용합니다. 중금속으로 함침되고 수지에 내장된 조직은 다이아몬드 나이프가 장착된 초미세토메를 함유한 주사 전자 현미경(SEM) 내에 배치됩니다. 평평한 표면은 다이아몬드 칼로 절단되고, 칼은 후퇴하고, 블록의 표면은 조직 울트라 구조의 이미지를 만들기 위해 전자 빔이있는 래스터 패턴으로 스캔됩니다. 그런 다음 블록은 z축에서 지정된 양(예: 100 nm)을 제기하고”z-step”이라고 하며 프로세스가 반복되기 전에 새 표면이 절단됩니다. 이러한 방식으로 조직의 절단으로 3차원(3D) 이미지 블록이 생성된다. 이 이미징 시스템은 장치의 자동화된 특성으로부터 더 많은 이점을 누릴 수 있으므로 이미징 프로세스 중에 현미경을 방치하고 하루 만에 수백 개의 이미지를 자동화하여 수집할 수 있습니다.

SBF-SEM 이미징은 주로 백산전자를 사용하여 블록 페이스의 이미지를 형성하지만, 이차 전자는 이미징프로세스(12)중에 생성된다. 이차 전자는 블록을 탈출하지 않는 백산및 1차 빔 전자와 함께 축적될 수 있으며 블록 페이스에서 국소화된 정전기장으로 이어질 수 있는 “조직 충전”을 생성할 수 있습니다. 이러한 전자 축적은 영상을 왜곡하거나 전자가 블록으로부터 배출되는 원인이 되며 백스캐터 검출기에 의해 수집된 신호에 기여하여 신호 대 잡음비(13)를감소시킬 수 있다. 조직 충전의 수준은 전자 빔 전압 또는 강도를 감소시켜 감소 할 수 있지만, 빔 거주 시간을 감소, 이 감소 신호 대 잡음 비율(14)발생. 저전압 또는 강도의 전자 빔이 사용되거나, 빔이 짧은 시간 동안 각 픽셀 공간 내에만 거주할 수 있는 경우, 백산전자가 조직에서 배출되어 전자 검출기에 의해 포획되어 신호가 약해진다. 덴크와 호르스트만은 챔버에 수증기를 도입하여 이 문제를 처리하여 심실과 블록 페이스의 전하를 이미지 해상도로 줄였습니다. 10-100 Pa의 챔버 압력으로, 전자 빔의 일부가 이미지 잡음 및 해상도 의 손실에 기여하는 산란되지만, 이것은 또한 샘플 블록2내의 전하를 중화시 챔버에서 이온을 생성한다. 시료 블록 내에서 전하를 중화하는 방법은 이미징 중에 블록 페이스에 질소의 초점 가스 주입을 사용하거나, SBF-SEM 단계에 음수 전압을 도입하여 프로브 빔-라딩 에너지를 감소시키고 수집된 신호수집 6,7,15를증가시킵니다. 블록 표면에 전하 축적을 감소시키기 위해 단계 바이어스, 챔버 압력 또는 국소화질소 주입을 도입하는 대신, 수지 믹스에 탄소를 도입하여 수지의 전도도를 높일 수 있어 더욱 공격적인 이미징설정(16)이가능하다. 다음 일반적인 프로토콜은 2010년에 발표된 Deerinck 외 프로토콜의 적응이며, 고해상도 이미지 수집3,17,18,19를 유지하면서 조직 충전을 최소화하는 데 유용하다고 판단한 조직 제제 및 이미징 방법론에 대한수정을다룹니다. 이전에 언급된 프로토콜은 조직 처리 및 중금속 함침에 초점을 맞추고 있지만, 이 프로토콜은 SBF-SEM 연구에 내재된 이미징, 데이터 분석 및 재구성 워크플로우에 대한 통찰력을 제공합니다. 우리의 실험실에서, 이 프로토콜은 성공적으로 및 각막 및 전방 세그먼트 구조를 포함하여 조직의 다양한에 성공적으로 재현적으로 적용되었습니다, 눈꺼풀, 홍엽 및 하심자 동맥, 망막 및 시신경, 심장, 폐 및 기도, 신장, 간, 크레마스터 근육, 대뇌 피질/수질, 마우스, 쥐, 토끼, 기니 피그, 물고기, 단층 및 계층화된 세포 배양, 돼지, 비인간 영장류, 인간20,21,23,23. 사소한 변화는 특정 조직 및 응용 프로그램에 가치가있을 수 있지만,이 일반적인 프로토콜은 우리의 핵심 이미징 시설의 맥락에서 매우 재현하고 유용 입증했다.

Protocol

모든 동물은 비전과 안과 연구에서 동물의 사용을위한 비전 및 안과 성명서와 휴스턴 대학 의 안과 동물 취급 지침에 따라 연구 협회에 설명 된 지침에 따라 처리되었습니다. 모든 동물 절차는 처리된 기관에 의해 승인되었습니다: 마우스, 쥐, 토끼, 기니 피그 및 비인간 영장류 절차는 휴스턴 동물 관리 및 사용 위원회의 대학에 의해 승인되었습니다, 제브라피시 절차는 DePauw 대학 동물 관리 및 사…

Representative Results

마우스 각막이 프로토콜은 마우스 각막에 광범위하게 적용되었습니다. SBF-SEM 이미징을 사용하여 엘라스틴이 없는 마이크로피브릴 번들(EFMBs)의 네트워크를 사용하여 성인용 마우스 각막 내에 존재하는 것으로 나타났다. 이전에는 이 네트워크가 배아와 조기 산후 발달 중에만 존재한다고 믿었습니다. SBF-SEM은 각막 전체에 걸쳐 광범위한 EFMB 네트워크를 공개했으며, 개별 섬유는 단?…

Discussion

이 방법 논문의 목적은 우리의 실험실이 안정적으로 고해상도 직렬 전자 현미경 이미지를 캡처 할 수 있도록 조직 준비 및 이미징 방법론을 강조하고, SBF-SEM 이미징을 수행 할 때 발생할 수있는 잠재적 인 함정뿐만 아니라이 결과로 이어지는 중요한 단계를 지적하는 것입니다. 이 프로토콜을 사용하여 성공하려면 조직의 적절한 고정, 시료에 중금속의 함침, 충전을 줄이기 위한 포함 수지수정, 이?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

샘 핸런 박사, 에블린 브라운, 마가렛 곤도 박사의 뛰어난 기술 지원에 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 (NIH) R01 EY-018239 및 P30 EY007551 (국립 안과 연구소)에 의해 부분적으로 지원되었으며, 부분적으로 NIH 1R15 HD084262-01 (국립 아동 건강 및 인간 발달 연구소)에 의해 지원되었습니다.

Materials

1/16 x 3/8 Aluminum Rivets Industrial Rivet & Fastener Co. 6N37RFLAP/1100 Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver Wiha Quality Tools 27225
Acetone Electron Microscopy Sciences RT 10000 Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid Sigma-Aldrich A8949
Calcium Chloride FisherScientific C79-500
Conductive Silver Paint Ted Pella 16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target Denton Vacuum N/A This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors Fisher Scientific 50-949-411
Embed 812 Electron Microscopy Sciences 14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM Gatan & Tescan N/A This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml) Electron Microscopy Sciences 72630-05
Gluteraldehyde Electron Microscopy Sciences 16320
Gorilla Super Glue – Impact Tough NA NA Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black HM Royal EC-600JD Refered to as carbon black in text.
KOH FisherScientific 18-605-593
Lead Nitrate Fisher Scientific L62-100
Microwave Pelco BioWave Pro This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide Sigma-Aldrich 201030
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich P9387
Silicone Embedding Mold Ted Pella 10504
Sodium Cacodylate Trihydrate Electron Microscopy Sciences 12300
Samco Transfer Pipette ThermoFisher Scientific 202 Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files Electron Microscopy Sciences 62115
Thiocarbohydrazide Sigma-Aldrich 223220
Uranyl Acetate Polysciences, Inc. 21447-25
Reconstruction Software
Amira Software Thermo Scientific N/A Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ) ImageJ.net N/A TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB) University of Helsinki, Institute of Biotechnology N/A
Reconstuct Software Neural Systems Lab N/A
SuRVoS Workbench Diamond Light Source & The University of Nottingham N/A
SyGlass IstoVisio, Inc. N/A Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.
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Courson, J. A., Landry, P. T., Do, T., Spehlmann, E., Lafontant, P. J., Patel, N., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples. J. Vis. Exp. (169), e62045, doi:10.3791/62045 (2021).
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