En hurtig madpræferenceanalyse i Drosophila

Summary

Vi præsenterer en protokol for en to-valg fodring assay for fluer. Denne fodringsanalyse er hurtig og nem at køre og er velegnet ikke kun til mindre laboratorieforskning, men også til adfærdsskærme med høj gennemløb i fluer.

Abstract

For at vælge fødevarer med næringsværdi og samtidig undgå indtagelse af skadelige stoffer har dyr brug for et sofistikeret og robust smagssystem for at evaluere deres fødevaremiljø. Frugtfluen, Drosophila melanogaster, er en genetisk tractable modelorganisme, der i vid udstrækning bruges til at dechifrere de molekylære, cellulære og neurale fundamenter for fødevarepræference. For at analysere fluemadpræference er der brug for en robust fodringsmetode. Beskrevet her er en to-valg fodring assay, som er streng, omkostningsbesparende, og hurtigt. Analysen er Petri-parabol-baseret og indebærer tilsætning af to forskellige fødevarer suppleret med blåt eller rødt farvestof til de to halvdele af skålen. Derefter ~ 70 forstjernede, 2-4-dages gamle fluer placeres i skålen og får lov til at vælge mellem blå og røde fødevarer i mørke i ca. 90 minutter. Undersøgelse af maven af hver flue efterfølges af beregningen af præferenceindekset. I modsætning til multiwell plader, tager hver Petri parabol kun ~ 20 s til at fylde og sparer tid og kræfter. Denne fodringsanalyse kan anvendes til hurtigt at afgøre, om fluer kan lide eller ikke lide en bestemt mad.

Introduction

På trods af dramatiske forskelle i smagsorganernes anatomiske struktur mellem fluer og pattedyr ligner fluernes adfærdsmæssige reaktioner på mange smagsstoffer påfaldende pattedyr. For eksempel foretrækker fluer sukker^{1,2,3,4,5,6,7,8}, aminosyrer^9,10og lavt salt¹¹, som angiver næringsstoffer, men afviser bitre fødevarer^12,13,14,^15, der er ubehagelige eller giftige. I løbet af de sidste to årtier har fluer vist sig at være en meget værdifuld modelorganisme for at fremme forståelsen af mange grundlæggende spørgsmål relateret til smagsoplevelse og fødevareforbrug, herunder smagsdetektering, smagstransduktion, smagsplastik og fodringsregulering^{16,17,18,19,20}. Bemærkelsesværdigt, en række undersøgelser har vist, at smagen transduktion og neurale kredsløb mekanismer underliggende smag opfattelse er analoge mellem frugt fluer og pattedyr. Derfor tjener frugtfluen som en ideel eksperimentel organisme, der gør det muligt for forskere at afdække evolutionært bevarede begreber og principper, der styrer fødevaredetektion og forbrug i dyreriget.

For at undersøge smagsoplevelse i fluer er det vigtigt at etablere en hurtig og streng analyse for objektivt at måle fødevarepræference. I årenes løb har forskellige fodringsmetoder, såsom farvestof-baserede assays^{11,12,13,21,22,23}, fluen proboscis udvidelse svar assay²⁴, Capillary Feeder (CAFE) assay^25,26, Fly Liquid-Food Interaction Counter (FLIC) assay²⁷og andre kombinatoriske metoder er udviklet til kvantitativ måling af fødevarepræferencer og/eller fødeindtagelse for frugtfluer^28,29,30,31. En af de populære fodring paradigmer er farvestof-baserede to-valg fodring assay ved hjælp af enten en multiwell microtiter plade^12,21,32 eller, som beskrevet her, en lille Petri parabol^11,22 som fodring kammer. Denne analyse er designet baseret på gennemsigtigheden af fluens underliv. Under denne analyse placeres fluer i fodringskammeret og præsenteres med to madmuligheder blandet med enten rødt farvestof eller blåt farvestof. Når analysen er færdig, vises flyvelivet rødt eller blåt afhængigt af hvilken mad de har indtaget.

Både Petri-skålen og de multiwell-plade farvestof-baserede fodring assays er meget robuste og giver omtrent de samme resultater. Ved hjælp af disse to assays, talrige vigtige opdagelser og gennembrud er blevet gjort i retning af at dechifrere de meget diversificerede receptorer og celler, der er ansvarlige for sensing mad smag og mad tekstur^{11,12,21,22,32,33}. I den farvebaserede analyse er et eksperimentelt skridt, der kræver betydelig tid og kræfter, at forberede og indlæse mad i fodringskammeret. For at reducere tilberednings- og pålæsningstiden blev denne analyse ændret ved at erstatte multiwell mikrotiterpladen med en lille petriskål, som er opdelt i to lige store rum. I petriskålsbaseret analyse tilsættes to forskellige fødevarer suppleret med blåt eller rødt farvestof til de to halvdele af skålen. Derefter ~ 70 forstjernede, 2-4-dages gamle fluer placeres i skålen og får lov til at vælge mellem blå og røde fødevarer i mørke i ca. 90 minutter. Underlivet af hver flue undersøges derefter, og præferenceindekset (PI) beregnes.

Denne Petri-parabol-baserede to-valg fodring assay er overkommelig, enkel og hurtig. En multiwell plade kræver ca 110 s til at fylde, mens hver Petri parabol tager kun ~ 20 s. Derudover kræver multiwellpladen pipettering af små mængder mad i et stort antal små brønde (f.eks. 60 eller flere brønde pr. Plade), hvilket kræver betydelig præcision og opmærksomhed. Omvendt petriskål-baserede assay kræver kun to handlinger pr plade. Da fodringsanalysen kan involvere et stort antal replikater, sparer petriskålsbaseret analyse en ikke-privat mængde tid og kræfter. Denne analyse giver resultater svarende til dem fra den multiwell-baserede analyse og har vist sig at have succes med at løse mange grundlæggende spørgsmål i smagsoplevelse, herunder saltsmag kodning¹¹, smag plasticitet modificeret af madoplevelse²², og det molekylære grundlag for mad tekstur sensation³³. Sammenfattende er denne Petri-parabol-baserede to-valg assay et kraftfuldt værktøj til at undersøge, hvordan fluer opfatter eksterne og interne næringsstoffer miljø til at fremkalde passende fodring adfærd.

Protocol

1. Samling af analysekamrene BEMÆRK: Mens denne protokol beskriver brugen af en 35 mm petriskål (Figur 1A), kan den ønskede effekt opnås ved hjælp af enhver vandtæt, glatbundet beholder, der kan gennemskæres og dækkes. Først skal du gennemskrive en låget 35 mm petriskål ved at fastgøre en længde af plast (5 mm i bredden og 3 mm i højden) ned midterlinjen med vandtæt klæbemiddel, der danner to vandtætte rum. Bekræft, at forseglingen er f…

Representative Results

I denne analyse blev en 35 mm skål opdelt i to lige store føderum, hvor hver halvdel af skålen indeholdt agarosefødevarer kombineret med enten blåt eller rødt farvestof (Figur 1A). For at udelukke farvestof bias, den blå og røde farvestof koncentrationer blev omhyggeligt raffineret til at give en omtrentlig “0” PI, når kun disse to farvestoffer blev tilføjet (Figur 1B). Når petriskålen var fyldt med testet mad, blev ~ 70 vådsultne, 2-4-dages gamle v…

Discussion

Denne metode involverer flere afgørende trin, hvor der kan opstå problemer. Først skal du sørge for, at fluer indtager en tilstrækkelig mængde mad til at give stabile data. Hvis fluer spiser dårligt, skal du sikre dig, at fluerne har været vådsultne i mindst 24 timer, og at de eksperimentelle medier indeholder mindst en minimal saccharosekoncentration (2 mM). For yderligere at stimulere fødevareforbruget skal du forlænge vådsultningsperioden ud over 24 timer afhængigt af fluernes fysiologiske tilstand. Hvis …

Materials

35 mm Petri dish	Fisher Scientific	08-772E
Agarose	Thomas Scientific	C756P56
Clear adhesive	Fisher Scientific	NC9884114
Conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	05-527-90
Dissection microscope	Amscope	SM-2T-6WB-V331
FCF Brilliant Blue	Wako Chemical	3844-45-9
Fly CO2 anesthesia setup	Genesee Scientfic	59-114/54-104M
Fly incubator with programmable day/night cycle	Powers Scientific Inc.	IS33SD
Fly lines
Glass dish (microwave-safe)
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A
Media storage bottle	Fisher Scientific	50-192-9998
Plastic divider cut to fit the dish from a sheet no thicker than 5 mm
Plastic fly vials	Genesee Scientific	32-116
Sucrose	Millipore Sigma	S9378
Sulforhodamine B	Millipore Sigma	S9012
Tastant compound of interest
Vortex mixer	Benchmark Scientific	BV1000
Water bath	Fisher Scientific	FSGPD05