Ein schneller Food-Preference-Test in Drosophila
Summary
Wir präsentieren ein Protokoll für einen Fütterungstest mit zwei Wahlmöglichkeiten für Fliegen. Dieser Fütterungstest ist schnell und einfach zu betreiben und eignet sich nicht nur für kleine Laborforschung, sondern auch für Verhaltensbildschirme mit hohem Durchsatz bei Fliegen.
Abstract
Um Lebensmittel mit Nährwert auszuwählen und gleichzeitig den Verzehr schädlicher Stoffe zu vermeiden, benötigen Tiere ein ausgeklügeltes und robustes Geschmackssystem, um ihre Lebensmittelumgebung zu bewerten. Die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, ist ein genetisch traktierbarer Modellorganismus, der weit verbreitet ist, um die molekularen, zellulären und neuronalen Grundlagen der Lebensmittelpräferenz zu entschlüsseln. Um die Präferenz von Fliegenfutter zu analysieren, ist eine robuste Fütterungsmethode erforderlich. Hier wird ein Fütterungstest mit zwei Wahlmöglichkeiten beschrieben, der streng, kostensparend und schnell ist. Der Assay ist Auf Petri-Schale-basist und beinhaltet die Zugabe von zwei verschiedenen Lebensmitteln mit blauem oder rotem Farbstoff zu den beiden Hälften der Schale ergänzt. Dann werden 70 vorverhungerte, 2-4 Tage alte Fliegen in das Gericht gelegt und dürfen für ca. 90 min zwischen blauen und roten Lebensmitteln im Dunkeln wählen. Auf die Untersuchung des Bauches jeder Fliege folgt die Berechnung des Präferenzindex. Im Gegensatz zu Multiwell-Platten benötigt jede Petrischale nur 20 s zum Füllen und spart Zeit und Mühe. Dieser Fütterungstest kann verwendet werden, um schnell festzustellen, ob Fliegen ein bestimmtes Futter mögen oder nicht mögen.
Introduction
Trotz dramatischer Unterschiede in der anatomischen Struktur von Geschmacksorganen zwischen Fliegen und Säugetieren sind die Verhaltensreaktionen der Fliegen auf viele Tastantsubstanzen auffallend ähnlich wie die von Säugetieren. Zum Beispiel bevorzugen Fliegen Zucker1,2,3,4,5,6,7,8, Aminosäuren9,10, und niedriges Salz11, die Nährstoffe anzeigen, aber ablehnen bittere Lebensmittel12,13,14,15, die ungenießbar oder giftig sind. In den letzten zwei Jahrzehnten haben sich Fliegen als ein sehr wertvoller Modellorganismus erwiesen, um das Verständnis vieler grundlegender Fragen im Zusammenhang mit Geschmacksempfinden und Lebensmittelkonsum zu fördern, einschließlich Tastanterkennung, Geschmacktransduktion, Geschmacksplastizität und Fütterungsverordnung16,17,18,19,20. Bemerkenswerterweise haben eine Reihe von Studien gezeigt, dass die Geschmacktransduktion und die neuronalen Schaltkreismechanismen, die der Geschmackswahrnehmung zugrunde liegen, analog zwischen Fruchtfliegen und Säugetieren sind. Daher dient die Fruchtfliege als idealer Versuchsorganismus, der es forschern ermöglicht, evolutionär konservierte Konzepte und Prinzipien aufzudecken, die die Erkennung und den Verzehr von Lebensmitteln im Tierreich regeln.
Um Geschmacksempfinden bei Fliegen zu untersuchen, ist es wichtig, einen schnellen und strengen Test zu etablieren, um die Lebensmittelpräferenz objektiv zu messen. Im Laufe der Jahre wurden verschiedene Fütterungsmethoden, wie färbebasierte Assays11,12,13,21,22,23, die Fly Proboscis Extension Response Assay24, die Capillary Feeder (CAFE) Assay25,26, Der Fly Liquid-Food Interaction Counter (FLIC) Assay27und andere kombinatorische Methoden wurden entwickelt, um die Lebensmittelpräferenz und/oder die Nahrungsaufnahme für Fruchtfliegen28,29,30,31quantitativ zu messen. Eines der beliebten Fütterungsparadigmen ist der auf Farbstoffbasierende Zwei-Wahl-Fütterungstest mit entweder einer Multiwell-Mikrotiterplatte12,21,32 oder, wie hier beschrieben, einer kleinen Petrischale11,22 als Futterkammer. Dieser Test basiert auf der Transparenz des Abdomens der Fliege. Während dieses Testes werden fliegende in die Futterkammer gelegt und mit zwei Nahrungsoptionen gemischt mit rotem Farbstoff oder blauem Farbstoff präsentiert. Sobald der Test abgeschlossen ist, fliegen Abdomen erscheinen rot oder blau, je nachdem, welche Nahrung sie konsumiert haben.
Sowohl die Petri-Schale als auch die Futtertests auf Multiwell-Platte-Farbe sind sehr robust und liefern ungefähr die gleichen Ergebnisse. Mit diesen beiden Assays wurden zahlreiche wichtige Entdeckungen und Durchbrüche gemacht, um die sehr diversifizierten Rezeptoren und Zellen zu entschlüsseln, die für die Erfassung von Nahrungsgeschmack und Lebensmitteltextur11,12,21,22,32,33verantwortlich sind. Im färbenbasierten Assay erfordert ein Versuchsschritt, der viel Zeit und Mühe erfordert, die Zubereitung und Verladung von Lebensmitteln in die Futterkammer. Um die Zubereitungs- und Ladezeit der Nahrung zu reduzieren, wurde dieser Test durch den Austausch der Multiwell-Mikrotiterplatte durch eine kleine Petrischale modifiziert, die in zwei gleiche Fächer unterteilt ist. In der Petri-Schale-basierte Assay, zwei verschiedene Lebensmittel mit blauen oder roten Farbstoff ergänzt werden, um die beiden Hälften der Schale hinzugefügt. Dann werden 70 vorverhungerte, 2-4 Tage alte Fliegen in das Gericht gelegt und dürfen für ca. 90 min zwischen blauen und roten Lebensmitteln im Dunkeln wählen. Anschließend wird der Bauch jeder Fliege untersucht und der Präferenzindex (PI) berechnet.
Dieser Petri-Dish-basierte Zwei-Wahl-Futter-Assay ist erschwinglich, einfach und schnell. Eine Multiwell-Platte benötigt ca. 110 s zu füllen, während jede Petrischale nur 20 s benötigt. Darüber hinaus erfordert die Multiwell-Platte das Pipettieren kleiner Mengen von Lebensmitteln in eine große Anzahl kleiner Brunnen (z. B. 60 oder mehr Brunnen pro Platte), was erhebliche Präzision und Aufmerksamkeit erfordert. Umgekehrt erfordert der Petri-Dish-basierte Assay nur zwei Aktionen pro Platte. Da der Fütterungstest eine große Anzahl von Replikationen umfassen kann, spart der Petri-Dish-basierte Assay eine nicht triviale Menge an Zeit und Mühe. Dieser Assay liefert Ergebnisse, die denen aus dem multiwell-basierten Assay entsprechen und hat sich als erfolgreich bei der Behandlung vieler grundlegender Fragen in der Geschmackswahrnehmung erwiesen, einschließlich Salzgeschmackcodierung11, Geschmackplastizität modifiziert durch Lebensmittelerfahrung22, und die molekulare Basis der Lebensmitteltextur Sensation33. Zusammenfassend ist dieser Petri-Dish-basierte Zwei-Wahl-Assay ein leistungsfähiges Werkzeug, um zu untersuchen, wie Fliegen externe und innere Nährstoffmilieus wahrnehmen, um ein angemessenes Fütterungsverhalten zu entlocken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Methode umfasst mehrere entscheidende Schritte, bei denen Probleme auftreten können. Stellen Sie zunächst sicher, dass Fliegen eine ausreichende Menge an Nahrung aufnehmen, um stabile Daten bereitzustellen. Wenn Fliegen schlecht essen, stellen Sie sicher, dass die Fliegen mindestens 24 h nass verhungert sind und dass die experimentellen Medien mindestens eine minimale Saccharosekonzentration (2 mM) enthalten. Um den Verzehr von Lebensmitteln weiter anzukurbeln, verlängern Sie die Nasshungerzeit über 24 h, abhä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Tingwei Mi für die Unterstützung bei der Optimierung des Fütterungsassays mit zwei Wahlmöglichkeiten. Sie möchten auch Samuel Chan und Wyatt Koolmees für ihre Kommentare zum Manuskript danken. Dieses Projekt wurde von den National Institutes of Health Grants R03 DC014787 (Y.V.Z.) und R01 DC018592 (Y.V.Z.) und der Ambrose Monell Foundation finanziert.
Materials
| 35 mm Petri dish | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Agarose | Thomas Scientific | C756P56 | |
| Clear adhesive | Fisher Scientific | NC9884114 | |
| Conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Dissection microscope | Amscope | SM-2T-6WB-V331 | |
| FCF Brilliant Blue | Wako Chemical | 3844-45-9 | |
| Fly CO2 anesthesia setup | Genesee Scientfic | 59-114/54-104M | |
| Fly incubator with programmable day/night cycle | Powers Scientific Inc. | IS33SD | |
| Fly lines | |||
| Glass dish (microwave-safe) | |||
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Media storage bottle | Fisher Scientific | 50-192-9998 | |
| Plastic divider cut to fit the dish from a sheet no thicker than 5 mm | |||
| Plastic fly vials | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S9378 | |
| Sulforhodamine B | Millipore Sigma | S9012 | |
| Tastant compound of interest | |||
| Vortex mixer | Benchmark Scientific | BV1000 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD05 |
References
- Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 14110-14115 (2007).
- Dahanukar, A., Foster, K., van der Goes van Naters, W. M., Carlson, J. R. A Gr receptor is required for response to the sugar trehalose in taste neurons of Drosophila. Nature Neuroscience. 4 (12), 1182-1186 (2001).
- Ueno, K., et al. Trehalose sensitivity in Drosophila correlates with mutations in and expression of the gustatory receptor gene Gr5a. Current Biology. 11 (18), 1451-1455 (2001).
- Fujii, S., et al. Drosophila sugar receptors in sweet taste perception, olfaction, and internal nutrient sensing. Current Biology. 25 (5), 621-627 (2015).
- Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. Taste representations in the Drosophila brain. Cell. 117 (7), 981-991 (2004).
- Thorne, N., Chromey, C., Bray, S., Amrein, H. Taste perception and coding in Drosophila. Current Biology. 14 (12), 1065-1079 (2004).
- Slone, J., Daniels, J., Amrein, H. Sugar receptors in Drosophila. Current Biology. 17 (20), 1809-1816 (2007).
- Dus, M., et al. Nutrient sensor in the brain directs the action of the brain-gut axis in Drosophila. Neuron. 87 (1), 139-151 (2015).
- Toshima, N., Tanimura, T. Taste preference for amino acids is dependent on internal nutritional state in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Biology. 215 (16), 2827-2832 (2012).
- Melcher, C., Bader, R., Pankratz, M. J. Amino acids, taste circuits, and feeding behavior in Drosophila: towards understanding the psychology of feeding in flies and man. Journal of Endocrinology. 192 (3), 467-472 (2007).
- Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
- Moon, S. J., Kottgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Current Biology. 16 (18), 1812-1817 (2006).
- Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Current Biology. 30 (1), 17-30 (2020).
- Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. Journal of Neuroscience. 32 (4), 1429-1435 (2012).
- Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Current Opinion in Neurobiology. 19 (4), 345-353 (2009).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
- Scott, K. Gustatory processing in Drosophila melanogaster. Annual Review of Entomology. 63, 15-30 (2018).
- Freeman, E. G., Dahanukar, A. Molecular neurobiology of Drosophila taste. Current Opinion in Neurobiology. 34, 140-148 (2015).
- Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. 유전학. 119 (2), 399-406 (1988).
- Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nature Neuroscience. 16 (10), 1468-1476 (2013).
- Bantel, A. P., Tessier, C. R. Taste preference assay for adult Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (115), e54403 (2016).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e193 (2007).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder assay measures food intake in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55024 (2017).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).
- Yoshihara, M. Simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3625 (2012).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. A taste circuit that regulates ingestion by integrating food and hunger signals. Cell. 165 (3), 715-729 (2016).
- Jiang, L., Zhan, Y., Zhu, Y. Combining quantitative food-intake assays and forcibly activating neurons to study appetite in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e56900 (2018).
- Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19 (19), 1623-1627 (2009).
- Zhang, Y. V., Aikin, T. J., Li, Z., Montell, C. The basis of food texture sensation in Drosophila. Neuron. 91 (4), 863-877 (2016).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nature Communications. 5, 4560 (2014).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Molecular Brain. 8, 87 (2015).
- Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. 유전학. 208 (4), 1291-1309 (2018).
