ड्रोसोफिला में एक रैपिड फूड-प्रिफरेंस परख
Summary
हम मक्खियों के लिए दो-पसंद फीडिंग परख के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह फीडिंग परख तेज और चलाने में आसान है और न केवल छोटे पैमाने पर प्रयोगशाला अनुसंधान के लिए उपयुक्त है, बल्कि मक्खियों में उच्च-थ्रूपुट व्यवहार स्क्रीन के लिए भी उपयुक्त है।
Abstract
हानिकारक एजेंटों की खपत से बचने के दौरान पोषण मूल्य के साथ भोजन का चयन करने के लिए, जानवरों को अपने खाद्य वातावरण का मूल्यांकन करने के लिए एक परिष्कृत और मजबूत स्वाद प्रणाली की आवश्यकता होती है। फल मक्खी, ड्रोसोफिला मेलनोगेस्टर,एक आनुवंशिक रूप से ट्रैक्टेबल मॉडल जीव है जिसका व्यापक रूप से आणविक, सेलुलर और तंत्रिका आधार को समझने के लिए उपयोग किया जाता है। फ्लाई फूड प्रिफरेंस का विश्लेषण करने के लिए, एक मजबूत भोजन विधि की आवश्यकता है। यहां वर्णित एक दो विकल्प खिला परख है, जो कठोर, लागत की बचत, और तेजी से है । परख पेट्री-डिश आधारित है और इसमें डिश के दो हिस्सों में नीले या लाल रंग के साथ पूरक दो अलग-अलग खाद्य पदार्थों के अलावा शामिल है। फिर, ~ 70 prestarved, 2-4 दिन पुरानी मक्खियों पकवान में रखा जाता है और के बारे में ९० मिनट के लिए अंधेरे में नीले और लाल खाद्य पदार्थों के बीच चयन करने की अनुमति दी । प्रत्येक मक्खी के पेट की परीक्षा वरीयता सूचकांक की गणना के बाद होती है। मल्टीवेल प्लेटों के विपरीत, प्रत्येक पेट्री डिश को भरने और समय और प्रयास को बचाने के लिए केवल ~ 20 एस लेता है। इस खिला परख को जल्दी से यह निर्धारित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है कि मक्खियों की तरह उड़ता है या किसी विशेष भोजन को नापसंद करता है।
Introduction
मक्खियों और स्तनधारियों के बीच स्वाद अंगों की शारीरिक संरचना में नाटकीय अंतर के बावजूद, कई टैस्टेंट पदार्थों के लिए मक्खियों की व्यवहार प्रतिक्रियाएं स्तनधारियों के समान हैं। उदाहरण केलिए, मक्खियां चीनी1,2,3,4,5,6,7,8,अमीनो एसिड9,10,और कम नमक11पसंद करती हैं, जो पोषक तत्वों का संकेत देती हैं, लेकिन कड़वे खाद्य पदार्थों को अस्वीकार करते हैं12,13,14,15 जो अप्रिय या जहरीले हैं। पिछले दो दशकों में, मक्खियों ने स्वाद सनसनी और भोजन की खपत से संबंधित कई मूलभूत प्रश्नों की समझ को आगे बढ़ाने के लिए एक अत्यधिक मूल्यवान मॉडल जीव साबित किया है, जिसमें टैस्टेंट डिटेक्शन, स्वाद ट्रांसडक्शन, स्वाद प्लास्टिसिटी और फीडिंग रेगुलेशन16,17,18,19,20शामिल हैं। उल्लेखनीय रूप से, कई अध्ययनों से पता चला है कि स्वाद लेनदेन और तंत्रिका सर्किट तंत्र अंतर्निहित स्वाद धारणा फल मक्खियों और स्तनधारियों के बीच अनुरूप हैं। इसलिए, फल मक्खी एक आदर्श प्रयोगात्मक जीव के रूप में कार्य करती है, जिससे शोधकर्ताओं को पशु साम्राज्य में खाद्य पहचान और खपत को नियंत्रित करने वाली विकासवादी संरक्षित अवधारणाओं और सिद्धांतों को उजागर करने में सक्षम बनाया जाता है।
मक्खियों में स्वाद सनसनी की जांच करने के लिए, भोजन वरीयता को निष्पक्ष रूप से मापने के लिए एक तेज और कठोर परख स्थापित करना महत्वपूर्ण है। पिछले कुछ वर्षों में, विभिन्न भोजन विधियों, जैसे डाई-आधारित परख11,12,13,21,22,23,फ्लाई सूंड विस्तार प्रतिक्रिया परख24,केसिलेरी फीडर (कैफे) परख25, 25,26,फ्लाई लिक्विड-फूड इंटरैक्शन काउंटर (एफएलआइसी) परख27,और अन्य संयोजन तरीकों को मात्रात्मक रूप से खाद्य वरीयता और/या फल मक्खियों के लिए भोजन का सेवन28, 29,30, 31को मापने के लिए विकसित किया गया है । लोकप्रिय भोजन प्रतिमानों में से एक डाई-आधारित दो-पसंद फीडिंग परख है जो या तो एक मल्टीवेल माइक्रोटेटर प्लेट12, 21,32 या, जैसा कि यहां वर्णित है, एक छोटा पेट्री डिश11,22 फीडिंग चैंबर के रूप में उपयोग करता है। यह परख मक्खी के पेट की पारदर्शिता के आधार पर बनाया गया है। इस परख के दौरान, मक्खियों को खिलाने वाले कक्ष में रखा जाता है और लाल डाई या नीले रंग के साथ मिश्रित दो खाद्य विकल्पों के साथ प्रस्तुत किया जाता है। एक बार परख पूरी हो जाने के बाद, फ्लाई पेट लाल या नीले दिखाई देते हैं, जिसके आधार पर उन्होंने भोजन का सेवन किया है।
पेट्री-डिश और मल्टीवेल-प्लेट डाई-आधारित फीडिंग परख दोनों अत्यधिक मजबूत हैं और लगभग एक ही परिणाम उत्पीठित होते हैं। इन दो परखों का उपयोग करते हुए, भोजन के स्वाद और भोजन की बनावट 11 ,12,22, 32 ,32,33को संवेदन करने के लिए उत्तरदायी अत्यधिक विविध रिसेप्टर्स और कोशिकाओं को समझने की दिशा में कई महत्वपूर्ण खोजें और सफलताएं की गई हैं । डाई आधारित परख में, एक प्रयोगात्मक कदम काफी समय और प्रयास की आवश्यकता होती है तैयार कर रहा है और खिला चैंबर में भोजन लोड हो रहा है । भोजन की तैयारी और लोडिंग समय को कम करने के लिए, इस परख को मल्टीवेल माइक्रोटिटर प्लेट को एक छोटे पेट्री डिश के साथ बदलकर संशोधित किया गया था, जिसे दो बराबर डिब्बों में विभाजित किया गया है। पेट्री-डिश बेस्ड परख में ब्लू या रेड डाई के साथ सप्लीमेंट करने वाले दो अलग-अलग फूड्स को डिश के दो हिस्सों में मिलाया जाता है । फिर, ~ 70 prestarved, 2-4 दिन पुरानी मक्खियों पकवान में रखा जाता है और के बारे में ९० मिनट के लिए अंधेरे में नीले और लाल खाद्य पदार्थों के बीच चयन करने की अनुमति दी । प्रत्येक फ्लाई के पेट की फिर जांच की जाती है, और वरीयता सूचकांक (पीआई) की गणना की जाती है।
इस पेट्री डिश आधारित दो विकल्प खिला परख सस्ती, सरल है, और तेजी से । एक मल्टीवेल प्लेट को भरने के लिए लगभग 110 एस की आवश्यकता होती है, जबकि प्रत्येक पेट्री डिश केवल ~ 20 एस लेती है। इसके अलावा, मल्टीवेल प्लेट को बड़ी संख्या में छोटे कुओं (जैसे, 60 या प्रति प्लेट वाले कुओं) में भोजन की छोटी मात्रा को पाइपिंग करने की आवश्यकता होती है, जो काफी सटीक और ध्यान की मांग करता है। इसके विपरीत, पेट्री-डिश आधारित परख के लिए प्रति प्लेट केवल दो क्रियाओं की आवश्यकता होती है। के रूप में खिला परख प्रतिकृति की एक बड़ी संख्या में शामिल कर सकते हैं, पेट्री पकवान आधारित परख समय और प्रयास की एक गैर-त्रयी राशि बचाता है । यह परख मल्टीवेल-आधारित परख से उन लोगों के बराबर परिणाम देता है और स्वाद सनसनी में कई बुनियादी सवालों को संबोधित करने में सफल साबित हुआ है, जिसमें नमक स्वाद कोडिंग11,खाद्य अनुभव द्वारा संशोधित प्लास्टिक का स्वाद22,और खाद्य बनावट सनसनी का आणविक आधार33शामिल है। संक्षेप में, यह पेट्री-डिश-आधारित दो-पसंद परख एक शक्तिशाली उपकरण है जो यह जांचने के लिए है कि मक्खियों को उचित भोजन व्यवहार प्राप्त करने के लिए बाहरी और आंतरिक पोषक तत्वों के परिवेश को कैसे देखते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस विधि में कई महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं जहां समस्याएं हो सकती हैं। सबसे पहले, सुनिश्चित करें कि मक्खियों स्थिर डेटा प्रदान करने के लिए पर्याप्त मात्रा में भोजन निगलना। यदि मक्खियां खराब खाती हैं, तो स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक डॉ टिंगवेई एमआई को दो पसंद के फीडिंग परख को अनुकूलित करने में मदद करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं । वे पांडुलिपि पर अपनी टिप्पणियों के लिए सैमुअल चान और वायाट कूलमीस को भी धन्यवाद देना चाहेंगे । इस परियोजना को स्वास्थ्य अनुदान के राष्ट्रीय संस्थानों R03 DC014787 (Y.V.Z.) और R01 DC018592 (Y.V.Z.) और एम्ब्रोस Monell फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।
Materials
| 35 mm Petri dish | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Agarose | Thomas Scientific | C756P56 | |
| Clear adhesive | Fisher Scientific | NC9884114 | |
| Conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Dissection microscope | Amscope | SM-2T-6WB-V331 | |
| FCF Brilliant Blue | Wako Chemical | 3844-45-9 | |
| Fly CO2 anesthesia setup | Genesee Scientfic | 59-114/54-104M | |
| Fly incubator with programmable day/night cycle | Powers Scientific Inc. | IS33SD | |
| Fly lines | |||
| Glass dish (microwave-safe) | |||
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Media storage bottle | Fisher Scientific | 50-192-9998 | |
| Plastic divider cut to fit the dish from a sheet no thicker than 5 mm | |||
| Plastic fly vials | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S9378 | |
| Sulforhodamine B | Millipore Sigma | S9012 | |
| Tastant compound of interest | |||
| Vortex mixer | Benchmark Scientific | BV1000 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD05 |
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