Быстрый продовольственно-преференциальный анализ в Дрозофиле
Summary
Представляем протокол для анализа кормления мух по два выбора. Это кормление анализ быстро и легко работать и подходит не только для небольших лабораторных исследований, но и для высокой пропускной способности поведенческих экранов у мух.
Abstract
Чтобы выбрать пищу с питательной ценностью, избегая при этом потребления вредных веществ, животные нуждаются в сложной и надежной системе вкуса для оценки их пищевой среды. Плодовая муха, Drosophila меланогастер, является генетически урочищенных модель организма, который широко используется для расшифровки молекулярных, клеточных и нейронных основ пищевых предпочтений. Для анализа предпочтений мухи питания необходим надежный метод кормления. Описано здесь два выбора кормления анализ, который является строгим, экономия средств, и быстро. Анализ на основе Петри-блюдо и включает в себя добавление двух различных продуктов, дополненных синим или красным красителем на две половинки блюда. Затем, 70 фунтов стерлингов prestarved, 2-4-дневные мухи помещаются в блюдо и разрешено выбирать между синими и красными продуктами в темноте около 90 минут. Изучение брюшной полости каждой мухи сопровождается расчетом индекса предпочтений. В отличие от многоэлеберных пластин, каждое блюдо Петри занимает всего 20 с, чтобы заполнить и экономит время и усилия. Это кормление анализ может быть использован для быстрого определения того, мухи, как или не нравится конкретной пищи.
Introduction
Несмотря на значительные различия в анатомической структуре вкусовых органов между мухами и млекопитающими, поведенческие реакции мух на многие вкусные вещества поразительно похожи на реакцию млекопитающих. Например, мухи предпочитаютсахар 1,2,3,4,5,6,7,8,аминокислоты 9,10инизкую соль11,которые указывают на питательные вещества, ноотвергают горькие продукты 12,13,14,15, которые являются неприятными или токсичными. За последние два десятилетия мухи зарекомендовали себя как очень ценная модель организма для продвижения понимания многих фундаментальных вопросов, связанных со вкусом ощущения и потребления пищи, в том числе вкус обнаружения, вкус трансдукции, вкусовой пластичности,и кормления регулирования 16,17,18,19,20. Примечательно, что ряд исследований показал, что вкус трансдукции и нейронных механизмов цепи, лежащих в основе восприятия вкуса аналогичны между плодовых мушек и млекопитающих. Таким образом, плодовая муха служит идеальным экспериментальным организмом, что позволяет исследователям раскрыть эволюционно сохраненные концепции и принципы, которые регулируют обнаружение и потребление пищи в животном мире.
Чтобы исследовать вкусовые ощущения у мух, очень важно установить быстрый и строгий анализ, чтобы объективно измерить предпочтения в еде. На протяжении многих лет различные методы кормления, такие как краситель наоснове анализов 11,12,13,21,22,23, летать хоботок расширение ответ анализ24, Капиллярный feeder (CAFE) анализ25,26, Fly Liquid-Food Взаимодействия Счетчик (FLIC) анализ27, и другие комбинаторные методы были разработаны для количественного измерения пищевых предпочтений и / или потребление пищи дляплодовых мушек 28,29,30,31. Одной из популярных парадигм кормления является краситель основе двух вариантов кормления анализа с использованием либо multiwell микротитрпластины 12,21,32 или, как описано здесь, небольшой чашки Петри11,22 в качестве кормунителя камеры. Этот анализ разработан на основе прозрачности живота мухи. Во время этого анализа, мухи помещаются в камеру кормления и представлены два варианта питания смешивается с красным красителем или синим красителем. После того, как анализ завершен, летать животы появляются красные или синие в зависимости от того, какую пищу они потребляли.
Как Петри-блюдо, так и многоявечее покрытие на основе красителя кормления являются весьма надежными и дают примерно одинаковые результаты. Используя эти два анализа, многочисленные важные открытия и прорывы были сделаны в направлении расшифровки высоко диверсифицированных рецепторов и клеток, ответственных за зондированиевкусов пищи и текстуры пищи 11,12,21,22,32,33. В анализе на основе красителя одним экспериментальным шагом, требующим значительного времени и усилий, является подготовка и загрузка пищи в кормовую камеру. Чтобы сократить время приготовления пищи и погрузки, этот анализ был изменен путем замены многоуровной пластины микротитр с небольшой чашкой Петри, которая разделена на два равных отсека. В анализе на основе чашки Петри в две половинки блюда добавляются две различные продукты, дополненные синим или красным красителем. Затем, 70 фунтов стерлингов prestarved, 2-4-дневные мухи помещаются в блюдо и разрешено выбирать между синими и красными продуктами в темноте около 90 минут. Затем изучается брюшной полости каждой мухи и рассчитывается индекс предпочтений (PI).
Это Петри-блюдо основе двух вариантов кормления анализ является доступным, простым и быстрым. Одна многоярдная пластина требует около 110 с для заполнения, в то время как каждая чашка Петри занимает всего 20 с. Кроме того, многоухардная пластина требует трубопроводов небольших объемов продовольствия в большое количество небольших скважин (например, 60 или более скважин на тарелку), что требует значительной точности и внимания. И наоборот, анализ на основе чашки Петри требует только двух действий на тарелку. Поскольку анализ кормления может включать в себя большое количество репликаций, анализ на основе петри-блюда экономит нетривиаляльное количество времени и усилий. Этот анализ дает результаты, эквивалентные тем из multiwell основе анализа и оказался успешным в решении многих фундаментальных вопросов в вкусовых ощущений, в том числесоль вкус кодирования 11, вкус пластичностьизменены пищевой опыт 22, и молекулярной основой пищевой текстурыощущение 33. Таким образом, это Петри-блюдо основе двух вариантов анализа является мощным инструментом для расследования того, как мухи воспринимают внешние и внутренние питательные среды, чтобы вызвать соответствующее поведение кормления.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот метод включает в себя несколько важных шагов, где проблемы могут возникнуть. Во-первых, убедитесь, что мухи ingest достаточное количество пищи, чтобы обеспечить стабильные данные. Если мухи едят плохо, убедитесь, что мухи были мокрые голодали, по крайней мере 24 ч, и что экспериментальны…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Tingwei Mi за помощь им оптимизировать два выбора кормления анализ. Они также хотели бы поблагодарить Сэмюэля Чана и Уайатта Кулмие за их комментарии к рукописи. Этот проект финансировался Национальными институтами здравоохранения грантов R03 DC014787 (Y.V.З.) и R01 DC018592 (Y.V.З.) и Фондом Амброуза Монелла.
Materials
| 35 mm Petri dish | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Agarose | Thomas Scientific | C756P56 | |
| Clear adhesive | Fisher Scientific | NC9884114 | |
| Conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Dissection microscope | Amscope | SM-2T-6WB-V331 | |
| FCF Brilliant Blue | Wako Chemical | 3844-45-9 | |
| Fly CO2 anesthesia setup | Genesee Scientfic | 59-114/54-104M | |
| Fly incubator with programmable day/night cycle | Powers Scientific Inc. | IS33SD | |
| Fly lines | |||
| Glass dish (microwave-safe) | |||
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Media storage bottle | Fisher Scientific | 50-192-9998 | |
| Plastic divider cut to fit the dish from a sheet no thicker than 5 mm | |||
| Plastic fly vials | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S9378 | |
| Sulforhodamine B | Millipore Sigma | S9012 | |
| Tastant compound of interest | |||
| Vortex mixer | Benchmark Scientific | BV1000 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD05 |
References
- Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 14110-14115 (2007).
- Dahanukar, A., Foster, K., van der Goes van Naters, W. M., Carlson, J. R. A Gr receptor is required for response to the sugar trehalose in taste neurons of Drosophila. Nature Neuroscience. 4 (12), 1182-1186 (2001).
- Ueno, K., et al. Trehalose sensitivity in Drosophila correlates with mutations in and expression of the gustatory receptor gene Gr5a. Current Biology. 11 (18), 1451-1455 (2001).
- Fujii, S., et al. Drosophila sugar receptors in sweet taste perception, olfaction, and internal nutrient sensing. Current Biology. 25 (5), 621-627 (2015).
- Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. Taste representations in the Drosophila brain. Cell. 117 (7), 981-991 (2004).
- Thorne, N., Chromey, C., Bray, S., Amrein, H. Taste perception and coding in Drosophila. Current Biology. 14 (12), 1065-1079 (2004).
- Slone, J., Daniels, J., Amrein, H. Sugar receptors in Drosophila. Current Biology. 17 (20), 1809-1816 (2007).
- Dus, M., et al. Nutrient sensor in the brain directs the action of the brain-gut axis in Drosophila. Neuron. 87 (1), 139-151 (2015).
- Toshima, N., Tanimura, T. Taste preference for amino acids is dependent on internal nutritional state in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Biology. 215 (16), 2827-2832 (2012).
- Melcher, C., Bader, R., Pankratz, M. J. Amino acids, taste circuits, and feeding behavior in Drosophila: towards understanding the psychology of feeding in flies and man. Journal of Endocrinology. 192 (3), 467-472 (2007).
- Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
- Moon, S. J., Kottgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Current Biology. 16 (18), 1812-1817 (2006).
- Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Current Biology. 30 (1), 17-30 (2020).
- Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. Journal of Neuroscience. 32 (4), 1429-1435 (2012).
- Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Current Opinion in Neurobiology. 19 (4), 345-353 (2009).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
- Scott, K. Gustatory processing in Drosophila melanogaster. Annual Review of Entomology. 63, 15-30 (2018).
- Freeman, E. G., Dahanukar, A. Molecular neurobiology of Drosophila taste. Current Opinion in Neurobiology. 34, 140-148 (2015).
- Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. 유전학. 119 (2), 399-406 (1988).
- Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nature Neuroscience. 16 (10), 1468-1476 (2013).
- Bantel, A. P., Tessier, C. R. Taste preference assay for adult Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (115), e54403 (2016).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e193 (2007).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder assay measures food intake in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55024 (2017).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).
- Yoshihara, M. Simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3625 (2012).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. A taste circuit that regulates ingestion by integrating food and hunger signals. Cell. 165 (3), 715-729 (2016).
- Jiang, L., Zhan, Y., Zhu, Y. Combining quantitative food-intake assays and forcibly activating neurons to study appetite in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e56900 (2018).
- Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19 (19), 1623-1627 (2009).
- Zhang, Y. V., Aikin, T. J., Li, Z., Montell, C. The basis of food texture sensation in Drosophila. Neuron. 91 (4), 863-877 (2016).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nature Communications. 5, 4560 (2014).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Molecular Brain. 8, 87 (2015).
- Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. 유전학. 208 (4), 1291-1309 (2018).
