En snabb livsmedelspreferensanalys i Drosophila
Summary
Vi presenterar ett protokoll för en tvåvals utfodringsanalys för flugor. Denna utfodringsanalys är snabb och lätt att köra och är lämplig inte bara för småskalig laboratorieforskning, men också för beteendeskärmar med hög genomströmning i flugor.
Abstract
För att välja mat med näringsvärde samtidigt som man undviker konsumtion av skadliga agenser behöver djuren ett sofistikerat och robust smaksystem för att utvärdera sin livsmedelsmiljö. Fruktflugan, Drosophila melanogaster, är en genetiskt dragbar modellorganism som ofta används för att dechiffrera de molekylära, cellulära och neurala grunderna för matpreferenser. För att analysera flugmatspreferenser behövs en robust utfodringsmetod. Beskrivs här är en tvåvals utfodringsanalys, som är rigorös, kostnadsbesparande och snabb. Analysen är Petri-dish-baserad och innebär tillsats av två olika livsmedel kompletterade med blått eller rött färgämne till de två halvorna av skålen. Sedan placeras ~ 70 förstjärniga, 2-4-dagars gamla flugor i skålen och får välja mellan blå och röd mat i mörkret i ca 90 min. Undersökning av buken i varje fluga följs av beräkningen av preferensindexet. I motsats till multiwell tallrikar tar varje Petri-maträtt bara ~ 20 s att fylla och sparar tid och ansträngning. Denna utfodringsanalys kan användas för att snabbt avgöra om flugor gillar eller ogillar en viss mat.
Introduction
Trots dramatiska skillnader i smakorganens anatomiska struktur mellan flugor och däggdjur, är flugornas beteendemässiga svar på många tastanta ämnen slående lika däggdjurens. Till exempel föredrar flugor socker1,2,3,4,5 ,6,7,8,aminosyror 9,10, och lågt salt11, som indikerar näringsämnen, men avvisar bittra livsmedel12,13,14,15 som är obehagliga eller giftiga. Under de senaste två decennierna har flugor visat sig vara en mycket värdefull modellorganism för att främja förståelsen av många grundläggande frågor relaterade till smaksensation och matkonsumtion, inklusive tastantdetektering, smaktransduktion, smak plasticitet och utfodringsreglering16,17,18,19,20. Anmärkningsvärt nog har ett antal studier visat att smaktransduktions- och neuralkretsmekanismerna bakom smakuppfattningen är analoga mellan fruktflugor och däggdjur. Därför fungerar fruktflugan som en idealisk experimentell organism, vilket gör det möjligt för forskare att avslöja evolutionärt bevarade begrepp och principer som styr livsmedelsdetektering och konsumtion i djurriket.
För att undersöka smaksensation i flugor är det viktigt att upprätta en snabb och rigorös analys för att objektivt mäta matpreferenser. Under årens lopp har olika utfodringsmetoder, såsom färgämnesbaserade analyser11,12,13,21,22,23, fly proboscis förlängning svarsanalys24, Kapillärmataren (CAFE) analys25,26, Fly Liquid-Food Interaction Counter (FLIC) analys27, och andra kombinatoriska metoder har utvecklats för att kvantitativt mäta matpreferens och / eller matintag för fruktflugor28,29,30,31. Ett av de populära utfodringsparadigmerna är den färgbaserade tvåvalsmatningsanalysen med antingen en multiwell microtiterplatta12,21,32 eller, som beskrivs här, en liten Petri-maträtt11,22 som matningskammare. Denna analys är utformad baserat på insynen i flugens buk. Under denna analys placeras flugor i matkammaren och presenteras med två matalternativ blandade med antingen rött färgämne eller blått färgämne. När analysen är klar verkar flyga buken röd eller blå beroende på vilken mat de har konsumerat.
Både Petri-skålen och multiwell-plate färgämnesbaserade utfodringsanalyser är mycket robusta och ger ungefär samma resultat. Med hjälp av dessa två analyser har många viktiga upptäckter och genombrott gjorts för att dechiffrera de mycket diversifierade receptorerna och cellerna som ansvarar för att känna av matsmak och matstruktur11,12,21,22,32,33. I den färgämnesbaserade analysen är ett experimentellt steg som kräver betydande tid och ansträngning att förbereda och ladda mat i utfodringskammaren. För att minska matberedningen och laddningstiden modifierades denna analys genom att ersätta multiwell microtiterplattan med en liten Petri-skål, som är uppdelad i två lika stora fack. I den Petri-dish-baserade analysen tillsätts två olika livsmedel kompletterade med blått eller rött färgämne till de två halvorna av skålen. Sedan placeras ~ 70 förstjärniga, 2-4-dagars gamla flugor i skålen och får välja mellan blå och röd mat i mörkret i ca 90 min. Buken i varje fluga undersöks sedan och preferensindexet (PI) beräknas.
Denna Petri-dish-baserade tvåvalsmatningsanalys är prisvärd, enkel och snabb. En multiwellplatta kräver cirka 110 s för att fylla, medan varje Petri-maträtt bara tar ~ 20 s. Dessutom kräver multiwellplattan pipettering av små volymer mat i ett stort antal små brunnar (t.ex. 60 eller fler brunnar per tallrik), vilket kräver stor precision och uppmärksamhet. Omvänt kräver den Petri-dish-baserade analysen endast två åtgärder per tallrik. Eftersom utfodringstestet kan involvera ett stort antal replikat sparar petriskålsbaserade analysen en icke-trivial mängd tid och ansträngning. Denna analys ger resultat som motsvarar dem från den multiwell-baserade analysen och har visat sig vara framgångsrika när det gäller att ta itu med många grundläggande frågor i smaksensation, inklusive saltsmakkodning11,smak plasticitet modifierad avmatupplevelse 22, och den molekylära grunden för matstruktur sensation33. Sammanfattningsvis är denna Petri-dish-baserade tvåvalsanalys ett kraftfullt verktyg för att undersöka hur flugor uppfattar yttre och inre näringsmiljö för att framkalla lämpligt utfodringsbeteende.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den här metoden innebär flera viktiga steg där problem kan uppstå. Se först till att flugor intar en tillräcklig mängd mat för att ge stabila data. Om flugor äter dåligt, se till att flugorna har varit våtsvultna i minst 24 timmar och att de experimentella medierna innehåller minst en minimal sackaroskoncentration (2 mM). För att ytterligare stimulera matkonsumtionen, förläng den våta svältperioden efter 24 timmar, beroende på flugornas fysiologiska tillstånd. Om för många flugor misslyckas med att ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Dr. Tingwei Mi för att hjälpa dem att optimera tvåvalsmatningsanalysen. De vill också tacka Samuel Chan och Wyatt Koolmees för deras kommentarer om manuskriptet. Detta projekt finansierades av National Institutes of Health grants R03 DC014787 (Y.V.Z.) och R01 DC018592 (Y.V.Z.) och ambrose Monell Foundation.
Materials
| 35 mm Petri dish | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Agarose | Thomas Scientific | C756P56 | |
| Clear adhesive | Fisher Scientific | NC9884114 | |
| Conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Dissection microscope | Amscope | SM-2T-6WB-V331 | |
| FCF Brilliant Blue | Wako Chemical | 3844-45-9 | |
| Fly CO2 anesthesia setup | Genesee Scientfic | 59-114/54-104M | |
| Fly incubator with programmable day/night cycle | Powers Scientific Inc. | IS33SD | |
| Fly lines | |||
| Glass dish (microwave-safe) | |||
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Media storage bottle | Fisher Scientific | 50-192-9998 | |
| Plastic divider cut to fit the dish from a sheet no thicker than 5 mm | |||
| Plastic fly vials | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S9378 | |
| Sulforhodamine B | Millipore Sigma | S9012 | |
| Tastant compound of interest | |||
| Vortex mixer | Benchmark Scientific | BV1000 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD05 |
References
- Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 14110-14115 (2007).
- Dahanukar, A., Foster, K., van der Goes van Naters, W. M., Carlson, J. R. A Gr receptor is required for response to the sugar trehalose in taste neurons of Drosophila. Nature Neuroscience. 4 (12), 1182-1186 (2001).
- Ueno, K., et al. Trehalose sensitivity in Drosophila correlates with mutations in and expression of the gustatory receptor gene Gr5a. Current Biology. 11 (18), 1451-1455 (2001).
- Fujii, S., et al. Drosophila sugar receptors in sweet taste perception, olfaction, and internal nutrient sensing. Current Biology. 25 (5), 621-627 (2015).
- Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. Taste representations in the Drosophila brain. Cell. 117 (7), 981-991 (2004).
- Thorne, N., Chromey, C., Bray, S., Amrein, H. Taste perception and coding in Drosophila. Current Biology. 14 (12), 1065-1079 (2004).
- Slone, J., Daniels, J., Amrein, H. Sugar receptors in Drosophila. Current Biology. 17 (20), 1809-1816 (2007).
- Dus, M., et al. Nutrient sensor in the brain directs the action of the brain-gut axis in Drosophila. Neuron. 87 (1), 139-151 (2015).
- Toshima, N., Tanimura, T. Taste preference for amino acids is dependent on internal nutritional state in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Biology. 215 (16), 2827-2832 (2012).
- Melcher, C., Bader, R., Pankratz, M. J. Amino acids, taste circuits, and feeding behavior in Drosophila: towards understanding the psychology of feeding in flies and man. Journal of Endocrinology. 192 (3), 467-472 (2007).
- Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
- Moon, S. J., Kottgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Current Biology. 16 (18), 1812-1817 (2006).
- Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Current Biology. 30 (1), 17-30 (2020).
- Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. Journal of Neuroscience. 32 (4), 1429-1435 (2012).
- Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Current Opinion in Neurobiology. 19 (4), 345-353 (2009).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
- Scott, K. Gustatory processing in Drosophila melanogaster. Annual Review of Entomology. 63, 15-30 (2018).
- Freeman, E. G., Dahanukar, A. Molecular neurobiology of Drosophila taste. Current Opinion in Neurobiology. 34, 140-148 (2015).
- Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. 유전학. 119 (2), 399-406 (1988).
- Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nature Neuroscience. 16 (10), 1468-1476 (2013).
- Bantel, A. P., Tessier, C. R. Taste preference assay for adult Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (115), e54403 (2016).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e193 (2007).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder assay measures food intake in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55024 (2017).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).
- Yoshihara, M. Simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3625 (2012).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. A taste circuit that regulates ingestion by integrating food and hunger signals. Cell. 165 (3), 715-729 (2016).
- Jiang, L., Zhan, Y., Zhu, Y. Combining quantitative food-intake assays and forcibly activating neurons to study appetite in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e56900 (2018).
- Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19 (19), 1623-1627 (2009).
- Zhang, Y. V., Aikin, T. J., Li, Z., Montell, C. The basis of food texture sensation in Drosophila. Neuron. 91 (4), 863-877 (2016).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nature Communications. 5, 4560 (2014).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Molecular Brain. 8, 87 (2015).
- Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. 유전학. 208 (4), 1291-1309 (2018).
