우리는 효모 사카로미세스 세레바시아에있는 수용성 대사산물의 주요 클래스의 식별 그리고 양을 위한 프로토콜을 제시합니다. 설명된 방법은 다재다능하고 견고하며 민감합니다. 그것은 서로 수용성 대사 산물의 구조 이소목 및 고정 관형 형태의 분리를 허용한다.
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방법 논문
탠덤 질량 분광과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로미세스 Cerevisiae의 정량적 Metabolomics
이 논문에서
요약
초록
Metabolomics는 세포 내의 많은 저분자 중량 중간체 및 물질 대사의 제품을 식별 및 정량화하는 데 사용되는 방법론입니다. 메타볼로믹스는 전통적으로 수용성 대사산물에 초점을 맞추고 있습니다. 수용성 메타볼로메는 다양한 게놈, 전형, 전사, 프로테오믹 및 환경 요인을 통합하는 복잡한 세포 네트워크의 최종 제품입니다. 따라서, metabolomic 분석은 각종 유기체 내의 생물학 프로세스의 과다에서 이 모든 요인에 대한 행동의 결과를 직접 평가합니다. 이러한 유기체 중 하나는 완전히 서열게놈을 가진 단세포 진핵생물인 신진 효모 사카로미세스 세레비시아입니다. S. cerevisiae는 포괄적인 분자 분석에 순종하기 때문에, 진핵 세포 내의 많은 생물학적 프로세스의 근본적인 기계장치를 해부하기위한 모델로 사용됩니다. 수용성 메타볼로메의 견고하고 민감하며 정확한 정량적 평가를 위한 다목적 분석 방법은 이러한 메커니즘을 해부하는 데 필수적인 방법론을 제공할 것입니다. 여기서 우리는 S. 세레비시아 세포로부터 담금질및 수용성 대사산물 추출의 최적화된 조건에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 또한 추출된 수용성 대사산물의 정량적 분석을 위해 탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)과 결합된 액체 크로마토그래피의 사용을 설명합니다. 여기에 설명된 비표적 메타볼로믹스의 LC-MS/MS 방법은 다재다능하고 견고합니다. 이러한 대사 산물의 다른 구조 이성질체 및 스테레오시컬 형태를 포함하여 다양한 구조적, 물리적 및 화학적 특성을 갖춘 370개 이상의 수용성 대사산물을 식별하고 정량화할 수 있습니다. 이 대사 산물은 각종 에너지 운반체 분자, 뉴클레오티드, 아미노산, 단당류, 글리코리시스의 중간체 및 삼환순환 중간체를 포함합니다. 비표적 메타볼로믹스의 LC-MS/MS 방법은 민감하며 0.05 pmol/μL의 농도에서 일부 수용성 대사산물의 식별 및 양을 확인할 수 있습니다. 이 방법은 다른 조건에서 배양된 야생형 및 돌연변이 효모 세포의 수용성 메타볼로메를 평가하는 데 성공적으로 사용되었습니다.
서론
수용성 대사 산물은 저분자-분자량 중간체및 필수 세포 과정에 기여하는 신진 대사의 제품입니다. 이러한 진화적으로 보존된 과정에는 영양분을 사용 가능한 에너지로 변환하는 것, 거대 분자의 합성, 세포 성장 및 신호, 세포 주기 제어, 유전자 발현 조절, 스트레스 반응, 대사 후 조절, 미토콘드리아 기능 유지, 혈관 세포 인신 매매, 자가 세포 노화 및 규제 된 세포 죽음1,2,3.
수용성 대사산물의 이러한 필수 역할중 상당수는 신진 효모 S. 세레비시아1,3,4,7,9,14,15,16,
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프로토콜
1. 효모 성장을 위한 배지 만들기 및 살균
- 180mL의 완전한 효모 추출물을 박테리아펩톤(YP) 배지로 만듭니다. 완전한 YP 배지에는 효모 추출물 1%(w/v) 및 2%(w/v) 바토펩톤이 포함되어 있습니다.
- YP 배지 180mL를 250mL 에렌마이어 플라스크 4개에 동등하게 분배한다. 이러한 플라스크 각각에는 YP 배지의 45mL가 포함되어 있습니다.
- 15 psi/121°C에서 45분 동안 자동화하여 YP 배지로 플라스크를 살균합니다.
2. 야생 형 효모 균주
- BY4742(MATαhis3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0)스트레인을 사용한다.
3. 2%의 포도당을 함유하는 YP 배지에서 효모 증가
- 포도당의 20% (w/v) 스톡 용액을 15 psi/121°C에서 45분 동안 자동화하여 살균합니다.
- 멸균 된 YP 배지의 45 mL로 두 Erlenmeyer 플라스크 각각에 포도당의 20 % (w /v) 스톡 용액의 5 mL을 추가합니다. YP 배지의 최종 농도 포도당은 2%(w/v)이다.
- 2% 포도당을 포함하는 YP 배지를....
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결과
효모 세포 내의 수용성 대사산물의 정량적 평가를 개선하기 위해 대사 산물 검출을 위한 세포 담금질 조건을 최적화했습니다. 이러한 목적을 위해 세포 담금질은세포31,33,37,38내의 모든 효소 반응의 신속한 체포를 포함한다. 이러한 세포대사 활성의 이러한 체포는 생체 내에서 수용성 대사산물의 양을 양화하는 방법의 필수적인 단계로서 세포내 농도31,33,37,38의과소 평가를 방지하기 때문이다. 대사 산.......
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토론
여기에 설명된 프로토콜을 성공적으로 사용하려면 아래에 설명된 예방 조치를 따르십시오. 클로로폼과 메탄올은 실험실 플라스틱 제품에서 다양한 물질을 추출합니다. 따라서 신중하게 처리하십시오. 이 두 유기 용매와 접촉하는 단계에서 플라스틱을 사용하지 마십시오. 이러한 단계에 는 보로실리케이트 유리 파이펫을 사용합니다. 사용하기 전에 클로로폼과 메탄올로 이 파이펫을 상승시보세요. 유기 용매에 강한 폴리 프로필렌으로 만든 마이크로 피펫 팁과 튜브만 사용하십시오. LC-MS/MS에 대한 샘플 준비 중에 유리 바이알의 모든 기포를 제거한 후 웰플레이트에 삽입합니다.
여기에 사용되는 zwitterionic 위상 열은 RT 시프트를 최소화하기 위해 각 실행 후 광범위한 재조정이 필요합니다. 열 재조정의 경우 컬럼의 약 20볼륨인 재조정 솔루션의 볼륨을 사용하는 것이 좋습니다. 0.4mL/min의 증가된 유량으로 15분 동안 초기 이동 단계로 열을 다시 조절해야 합니다. 재조정 중에 컬럼의 손상을.......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
우리는 토론에 대한 티토렌코 연구소의 현재와 전 회원에게 감사드립니다. 우리는 질량 분광학의 생물학 응용 센터를 인정합니다, 구조 및 기능 유전체학센터, 및 미해결 서비스를 위한 현미경 및 세포 화상 진찰 센터 (콩코르디아 대학에 모두). 이 연구는 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC)의 보조금에 의해 지원되었다 (RGPIN 2014-04482 CRDPJ 515900 - 17). K.M. 콩코르디아 대학 아르만드 C. 아캄볼트 펠로우십과 콩코르디아 대학 예술 과학 우수 학장의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Chemicals | |||
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| 아세트산 암모늄 | Fisher Scientific | A11450 | |
| 중탄산암모늄 | 시그마 | 9830 | |
| 박토펩톤 | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| 클로로포름 | Fisher Scientific | C297-4 | |
| 포도 | 피셔 사이언티픽 | D16-10 | |
| L-히스티딘 | 시그마 | H8125 | |
| L-류신 | 시그마 | L8912 | |
| L-라이신 | 시그마 | L5501 | |
| 메탄올 | 피셔 사이언티픽 | A4564 | |
| 메탄올 | 피셔 사이언티픽 | A4564 | |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | R37108 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| 효모 추출물 | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Hardware equipment | |||
| 500 ml 원심분리기 병 | Beckman | 355664 | |
| Agilent 1100 시리즈 LC 시스템 | Agilent Technologies | G1312A | |
| Beckman Coulter 원심분리기 | Beckman | 6254249 | |
| Beckman Coulter 원심분리기 로터 | Beckman | JA-10 | |
| Centra CL2 임상 원심분리기 | Thermo Scientific | 004260F | |
| 디지털 온도계 | Omega | HH509 | |
| 폼 튜브 홀더 키트(리테이너 | 포함 Thermo) Scientific | 02-215-388 | |
| SeQuant ZIC-pHILIC 왓베리온상 컬럼 (5&마이크로; m 폴리머 150 x 2.1 mm) | Sigma Milipore | 150460 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| 초음파 발생기 | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µ m | Agilent Technologies | 883725-901 | |
| Laboratory materials | |||
| 2-mL 유리 시료 바이알과 테플론 안감 캡 | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| 유리 구슬 (산 세척, 425-600 μ m) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| 혈구계 | Fisher Scientific | 267110 | |
| 15-mL 테프론 라이닝 캡이 있는 고속 유리 원심분리기 튜브 | PYREX | 05-550 | |
| Software | |||
| Compound Discoverer 3.1 | Fisher Scientific | V3.1 | |
| 효모 균주 | |||
| 효모 균주 BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
참고문헌
- Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786(2016).
- Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Ce....
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재인쇄 및 허가
