الأيض الكمي من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي الترادفي
Summary
نقدم بروتوكول لتحديد وكمية الفئات الرئيسية من الأيض للذوبان في الماء في الخميرة Saccharomyces cerevisiae. الطريقة الموصوفة متعددة الاستخدامات وقوية وحساسة. فإنه يسمح فصل ايزومرات الهيكلية وأشكال ستيريويسوميريك من الأيض للذوبان في الماء من بعضها البعض.
Abstract
الأيض هو منهجية تستخدم لتحديد وتحديد كمي من العديد من وسيطات الوزن الجزيئي المنخفض ومنتجات التمثيل الغذائي داخل الخلية أو الأنسجة أو الأعضاء أو السوائل البيولوجية أو الكائن الحي. يركز الميتابوميك تقليديا على الأيض القابل للذوبان في الماء. المستقلب القابل للذوبان في الماء هو المنتج النهائي لشبكة خلوية معقدة تدمج مختلف العوامل الجينومية، الجينومية، النسخية، البروتيومية، والبيئية. وبالتالي، فإن التحليل الأيضي يقيم مباشرة نتيجة العمل لجميع هذه العوامل في عدد كبير من العمليات البيولوجية داخل الكائنات الحية المختلفة. واحدة من هذه الكائنات الحية هي الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae، وهو eukaryote أحادي الخلية مع الجينوم تسلسل كامل. لأن S. cerevisiae قابلة للتحليلات الجزيئية الشاملة ، يتم استخدامه كنموذج لتشريح الآليات الكامنة وراء العديد من العمليات البيولوجية داخل الخلية eukaryotic. ومن شأن اتباع طريقة تحليلية متعددة الاستخدامات للتقييم الكمي القوي والحساس والدقيق للميبولوم القابل للذوبان في الماء أن يوفر المنهجية الأساسية لتشريح هذه الآليات. هنا نقدم بروتوكولا للظروف الأمثل من النشاط الأيضي في إرواء واستخراج المستقلب للذوبان في الماء من خلايا S. cerevisiae. ويصف البروتوكول أيضا استخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب (LC-MS/MS) للتحليل الكمي للميثابات المستخلصة القابلة للذوبان في الماء. طريقة LC-MS/MS من الأيض غير المستهدفة الموصوفة هنا متعددة الاستخدامات وقوية. وهو يتيح تحديد وتحديد كمي لأكثر من 370 المستقلبات القابلة للذوبان في الماء مع خصائص هيكلية ومادية وكيميائية متنوعة، بما في ذلك إيزومرات هيكلية مختلفة وأشكال ستيريويسوميريك من هذه الأيضات. وتشمل هذه الأيض جزيئات مختلفة الناقل الطاقة, النيوكليوتيدات, الأحماض الأمينية, السكريات الأحادية, وسيطة من انحلال الجليكوليسيس, ووسيطة دورة tricarboxylic. طريقة LC-MS/MS من الأيض غير المستهدفة حساسة وتسمح بتحديد وكمية بعض الأيضات القابلة للذوبان في الماء بتركيزات منخفضة يصل إلى 0.05 pmol/μL. وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح لتقييم الأيض للذوبان في الماء من خلايا الخميرة البرية من نوع ومتحولة المستزرعة في ظل ظروف مختلفة.
Introduction
الأيضات القابلة للذوبان في الماء هي وسيطة منخفضة الوزن الجزيئي ومنتجات التمثيل الغذائي التي تساهم في العمليات الخلوية الأساسية. وتشمل هذه العمليات المحفوظة تطوريا تحويل المواد الغذائية إلى طاقة قابلة للاستخدام، وتركيب الجزيئات الكبيرة، والنمو الخلوي والإشارات، والسيطرة على دورة الخلية، وتنظيم التعبير الجيني، والاستجابة للإجهاد، وتنظيم ما بعد الترجمة من التمثيل الغذائي، والحفاظ على وظائف الميتوكوندريا، والاتجار الخلوي المركبات، autophagy، الشيخوخة الخلوية، وتنظيم موت الخلية1،2،3.
وقد تم اكتشاف العديد من هذه الأدوار الأساسية من الأيض للذوبان في الماء من قبل الدراسات في الخميرة الناشئة S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. هذا eukaryote أحادي الخلية هو كائن نموذجي مفيد لتشريح الآليات التي من خلالها الأيض القابل للذوبان في الماء تساهم في العمليات الخلوية بسبب قابليتها للالمتقدمة البيوكيميائية والوراثية والجزيئية التحليلات البيولوجية23،24،25،26. على الرغم من أن أساليب LC-MS/MS من الأيض غير المستهدفة قد استخدمت لدراسة أدوار الأيض القابل للذوبان في الماء في الخميرة الناشئة3،18،22،27، يتطلب هذا النوع من التحليل تحسين براعة ، متانة ، حساسية ، والقدرة على التمييز بين مختلف الايزومرات الهيكلية والأشكال المجسمة لهذه الأيضات.
وتتميز السنوات الأخيرة من التقدم الكبير في تطبيق أساليب LC-MS/MS من الأيض غير المستهدفة إلى التنميط من الأيض للذوبان في الماء في الجسم الحي. ومع ذلك، لا تزال العديد من التحديات في استخدام هذه المنهجية2،28،29،30،31،32،33،34،35،36. وتشمل هذه التحديات ما يلي: أولا، تركيزات داخل الخلايا من العديد من الأيضات القابلة للذوبان في الماء هي أقل من عتبة الحساسية للطرق المستخدمة حاليا. ثانيا، كفاءة إرواء النشاط الأيضي منخفضة جدا، ومدى تسرب الخلايا المرتبطة بإرواء الأيض داخل الخلايا مرتفع جدا بالنسبة للطرق الحالية؛ وبالتالي، فإن الأساليب المستخدمة حاليا أقل تقدير تركيزات داخل الخلايا من الأيض للذوبان في الماء. ثالثا، لا يمكن للأساليب القائمة أن تميز بين الأيزومرات الهيكلية (أي الجزيئات ذات الصيغة الكيميائية نفسها ولكن الاتصال الذري المختلف) أو الجسيمات المجسمة (أي الجزيئات ذات الصيغة الكيميائية نفسها والاتصال الذري، ولكن مع الترتيب الذري المختلف في الفضاء) لمييضات محددة؛ وهذا يمنع التعليق التوضيحي الصحيح لبعض الأيضات بالطرق المستخدمة حاليا. رابعا، إن قواعد البيانات الطيفية الكتلية الموجودة على الإنترنت للتوابع الأصلية (MS1) والأيونات الثانوية (MS2) غير مكتملة؛ وهذا يؤثر على تحديد الصحيح والكمية من الأيض محددة باستخدام البيانات الخام LC-MS / MS المنتجة بمساعدة الأساليب الحالية. خامسا، لا يمكن استخدام الطرق القائمة نوع واحد من استخراج المستقلب لاسترداد جميع أو معظم فئات الأيض للذوبان في الماء. سادسا، لا يمكن استخدام الطرق الموجودة نوع واحد من العمود LC لفصل عن بعضها البعض جميع أو معظم فئات الأيض للذوبان في الماء.
هنا، ونحن الأمثل الظروف لإرواء النشاط الأيضي داخل خلايا S. cerevisiae، والحفاظ على معظم الأيض للذوبان في الماء داخل هذه الخلايا قبل الاستخراج، واستخراج معظم فئات الأيض للذوبان في الماء من خلايا الخميرة. طورنا طريقة متعددة الاستخدامات وقوية وحساسة لتحديد وتحديد كمية أكثر من 370 استقلاب قابل للذوبان في الماء مستخرج من خلايا S. cerevisiae. هذه الطريقة من الأيض غير المستهدفة تمكن من تقييم تركيزات داخل الخلايا من جزيئات الناقل الطاقة المختلفة, النيوكليوتيدات, الأحماض الأمينية, السكريات الأحادية, وسيطة من انحلال الجليكوليسيس, ووسيطة دورة tricarboxylic. تسمح طريقة LC-MS/MS المطورة بتحديد وتحديد كمي لمختلف الأيزومرات الهيكلية والأشكال المجسمة من الأيضات القابلة للذوبان في الماء ذات الخصائص الهيكلية والفيزيائية والكيميائية المتنوعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
لاستخدام البروتوكول الموضح هنا بنجاح، اتبع التدابير الوقائية الموضحة أدناه. الكلوروفورم والميثانول استخراج مواد مختلفة من البلاستيك المختبري. لذلك، التعامل معها بحذر. تجنب استخدام البلاستيك في الخطوات التي تنطوي على الاتصال مع أي من هذه المذيبات العضوية اثنين. استخدام ماصة الزجاج borosilic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للأعضاء الحاليين والسابقين في مختبر تيتورينكو على المناقشات. ونعترف بمركز التطبيقات البيولوجية لقياس الطيف الكتلي، ومركز الجينوم الهيكلي والوظيفي، ومركز الفحص المجهري والتصوير الخلوي (وكلها في جامعة كونكورديا) للخدمات المتميزة. وقد دعمت هذه الدراسة بمنح من مجلس بحوث العلوم الطبيعية والهندسة الكندي (RGPIN 2014-04482 وCRDPJ 515900 – 17). حصل ك.M على دعم زمالة أرشامبولت بجامعة كونكورديا وجائزة عميد الآداب والعلوم في جامعة كونكورديا للتميز.
Materials
| Chemicals | |||
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | R37108 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Hardware equipment | |||
| 500 ml centrifuge bottles | Beckman | 355664 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Beckman Coulter Centrifuge | Beckman | 6254249 | |
| Beckman Coulter Centrifuge Rotor | Beckman | JA-10 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Digital thermometer | Omega | HH509 | |
| Foam Tube Holder Kit with Retainer | Thermo Scientific | 02-215-388 | |
| SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) | Sigma Milipore | 150460 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm | Agilent Technologies | 883725-901 | |
| Laboratory materials | |||
| 2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| 15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| Software | |||
| Compound Discoverer 3.1 | Fisher Scientific | V3.1 | |
| Yeast strain | |||
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 | |
References
- Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786 (2016).
- Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (7), 451-459 (2016).
- Mülleder, M., et al. Functional metabolomics describes the yeast biosynthetic regulome. Cell. 167 (2), 553-565 (2016).
- López-Otín, C., Galluzzi, L., Freije, J., Madeo, F., Kroemer, G. Metabolic control of longevity. Cell. 166 (4), 802-821 (2016).
- Krishnaiah, S. Y., et al. Clock regulation of metabolites reveals coupling between transcription and metabolism. Cell Metabolism. 25 (4), 961-974 (2017).
- Lee, H. J. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports. 20 (3), 721-736 (2017).
- Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
- Babst, M. Eisosomes at the intersection of TORC1 and TORC2 regulation. Traffic. 20 (8), 543-551 (2019).
- Pedro, J., Sica, V., Madeo, F., Kroemer, G. Acyl-CoA-binding protein (ACBP): the elusive ‘hunger factor’ linking autophagy to food intake. Cell Stress. 3 (10), 312-318 (2019).
- Rahmani, S., Defferrari, M. S., Wakarchuk, W. W., Antonescu, C. N. Energetic adaptations: Metabolic control of endocytic membrane traffic. Traffic. 20 (12), 912-931 (2019).
- Viltard, M., et al. The metabolomic signature of extreme longevity: naked mole rats versus mice. Aging. 11 (14), 4783-4800 (2019).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (7), 436-450 (2019).
- Morrison, A. J. Chromatin-remodeling links metabolic signaling to gene expression. Molecular Metabolism. 38, 100973 (2020).
- Bitterman, K. J., Medvedik, O., Sinclair, D. A. Longevity regulation in Saccharomyces cerevisiae: linking metabolism, genome stability, and heterochromatin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 376-399 (2003).
- Carmona-Gutierrez, D. Apoptosis in yeast: triggers, pathways, subroutines. Cell Death and Differentiation. 17 (5), 763-773 (2010).
- Minois, N., Carmona-Gutierrez, D., Madeo, F. Polyamines in aging and disease. Aging. 3 (8), 716-732 (2011).
- Ring, J., et al. The metabolism beyond programmed cell death in yeast. Experimental Cell Research. 318 (11), 1193-1200 (2012).
- Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
- Pietrocola, F., et al. Acetyl coenzyme A: a central metabolite and second messenger. Cell Metabolism. 21 (6), 805-821 (2015).
- Carmona-Gutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
- Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), foy020 (2018).
- Leupold, S., et al. Saccharomyces cerevisiae goes through distinct metabolic phases during its replicative lifespan. eLife. 8, e41046 (2019).
- Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).
- Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st century biology. 유전학. 189 (3), 695-704 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. 유전학. 197 (1), 33-48 (2014).
- Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. 유전학. 208 (3), 833-851 (2018).
- Boer, V. M., et al. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular Biology of the Cell. 21 (1), 198-211 (2010).
- Clish, C. B. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harbor Molecular Case Studies. 1 (1), a000588 (2015).
- Fuhrer, T., Zamboni, N. High-throughput discovery metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 31, 73-78 (2015).
- Liu, X., Locasale, J. W. Metabolomics: A primer. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 274-284 (2017).
- Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Riekeberg, E., Powers, R. New frontiers in metabolomics: from measurement to insight. F1000 Reseach. 6, 1148 (2017).
- Gertsman, I., Barshop, B. A. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. 41 (3), 355-366 (2018).
- Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
- Ivanisevic, J., Want, E. J. From samples to insights into metabolism: Uncovering biologically relevant information in LC-HRMS metabolomics data. Metabolites. 9 (12), 308 (2019).
- Srivastava, S. Emerging insights into the metabolic alterations in aging using metabolomics. Metabolites. 9 (12), 301 (2019).
- Chetwynd, A. J., Dunn, W. B., Rodriguez-Blanco, G. Collection and preparation of clinical samples for metabolomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 19-44 (2017).
- Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), (2017).
- Zhang, N., et al. Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 4183-4191 (2018).
- Tu, B. P., et al. Cyclic changes in metabolic state during the life of a yeast cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16886-16891 (2007).
- Walvekar, A., Rashida, Z., Maddali, H., Laxman, S. A versatile LC-MS/MS approach for comprehensive, quantitative analysis of central metabolic pathways. Wellcome Open Research. 3, 122 (2018).
- Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
- Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
- Oberacher, H., et al. Annotating nontargeted LC-HRMS/MS data with two complementary tandem mass spectral libraries. Metabolites. 9 (1), 3 (2018).
- Tada, I., et al. Creating a reliable mass spectral-retention time library for all ion fragmentation-based metabolomics. Metabolites. 9 (11), 251 (2019).
- Villas-Bôas, S. G., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods. Yeast. 22 (14), 1155-1169 (2005).
- Crutchfield, C. A., Lu, W., Melamud, E., Rabinowitz, J. D. Mass spectrometry-based metabolomics of yeast. Methods in Enzymology. 470, 393-426 (2010).
- Zhang, T., Creek, D. J., Barrett, M. P., Blackburn, G., Watson, D. G. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Analytical Chemistry. 84 (4), 1994-2001 (2012).
- Villas-Bôas, S. G., Moxley, J. F., Akesson, M., Stephanopoulos, G., Nielsen, J. High-throughput metabolic state analysis: the missing link in integrated functional genomics of yeasts. Biochemical Journal. 388 (Pt 2), 669-677 (2005).
- Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
