स्वचालित छवि विश्लेषण का उपयोग कर कृंतक मॉडल के सब्सटेंटिया निग्रा में डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन घनत्व का अर्ध-मात्रात्मक निर्धारण
Summary
यहां हम चूहे सब्स्तानटिया निग्रा पार्स कॉम्पैक्टा में डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन नंबर के अर्ध-मात्रात्मक निर्धारण के लिए एक स्वचालित विधि प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
सब्स्टानिया निग्रा में डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स की संख्या का आकलन प्री-क्लीनिकल पार्किंसंस डिजीज रिसर्च में एक महत्वपूर्ण तरीका है। वर्तमान में, निष्पक्ष स्टीरियोलॉजिकल गिनती इन कोशिकाओं के मात्राकरण के लिए मानक है, लेकिन यह एक श्रमसाध्य और समय लेने वाली प्रक्रिया बनी हुई है, जो सभी परियोजनाओं के लिए व्यवहार्य नहीं हो सकती है। यहां, हम एक छवि विश्लेषण मंच के उपयोग का वर्णन करते हैं, जो ब्याज के पूर्व-परिभाषित क्षेत्र में लेबल कोशिकाओं की मात्रा का सटीक अनुमान लगा सकता है। हम चूहे के मस्तिष्क में विश्लेषण की इस विधि के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और प्रदर्शित करते हैं कि यह सब्स्तानटिया निग्रा में उत्परिवर्ती α-सिन्यूक्लिन की अभिव्यक्ति के कारण टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज सकारात्मक न्यूरॉन्स में एक महत्वपूर्ण कमी की पहचान कर सकता है। हमने निष्पक्ष स्टीरियोलॉजी द्वारा प्राप्त परिणामों के साथ तुलना करके इस पद्धति को मान्य किया। एक साथ लिया, यह विधि डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन संख्या में परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक समय कुशल और सटीक प्रक्रिया प्रदान करती है, और इस प्रकार सेल अस्तित्व पर हस्तक्षेप के प्रभाव के कुशल निर्धारण के लिए उपयुक्त है।
Introduction
पार्किंसंस रोग (पीडी) एक प्रचलित न्यूरोडीजेनेरेटिव मूवमेंट डिसऑर्डर है जो प्रोटीन समुच्चयिन (α α-सिन) और सब्सटेंटिया निग्रा पार्स कॉम्पैक्टा (एसएनपीसी)1में डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स के तरजीही नुकसान से युक्त प्रोटीन समुच्चय की उपस्थिति की विशेषता है। डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन संख्या का मात्राकरण पीडी अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है क्योंकि यह निग्रोस्ट्रिटल सिस्टम की अखंडता के मूल्यांकन की अनुमति देता है, इस प्रकार, संभावित रोग-संशोधित चिकित्सीय की प्रभावशीलता का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण अंतिम बिंदु प्रदान करता है। वर्तमान में, सेल संख्या के मात्राकरण के लिए मानक निष्पक्ष स्टीरियोलॉजिकल गिनती है, जो तीन आयामी (3 डी) संरचनाओं 2,3,4में वॉल्यूमेट्रिक सुविधाओं का अनुमान लगाने के लिए ऊतक के दो आयामी(2डी)क्रॉस-सेक्शन का उपयोग करता है। आधुनिक डिजाइन-आधारित स्टीरियोलॉजिकल विधियां व्यापक यादृच्छिक नमूना प्रक्रियाओं को नियोजित करती हैं और संभावित कलाकृतियों और व्यवस्थित त्रुटियों से बचने के लिए गिनती प्रोटोकॉल (जांच के रूप में जाना जाता है) लागू करती हैं, जिससे अंतर-पशु भिन्नता5की तुलना में अंतर का विश्वसनीय पता लगाने की अनुमति होती है। जबकि स्टीरियोलॉजी वीवो हिस्टोलॉजिकल अध्ययनों में एक शक्तिशाली विश्लेषणात्मक उपकरण प्रदान करता है, यह समय गहन है, एक समान नमूना तैयारी मानता है, और कई चरणों पर सत्यापन की आवश्यकता होती है, जो पूर्व-नैदानिक ट्रांसलेशनल जांच के लिए आवश्यक दक्षता को प्रभावित कर सकती है।
डिजिटल विज्ञान में हाल ही में तकनीकी प्रगति निष्पक्ष स्टीरियोमाइप्रोस्कोप के बिना पैथोलॉजी के अधिक कुशल मूल्यांकन के लिए उपन्यास अनुप्रयोगों को अपनाना संभव बनाती है, जबकि निष्पक्ष स्टीरियोलॉजी के किराए के रूप में आवश्यकता को भरना। ये विधियां गति बढ़ाती हैं, मानवीय त्रुटि को कम करते हैं, और स्टीरियोलॉजिकल तकनीकों की प्रजनन क्षमता में सुधार करते हैं6,7। हेलो डिजिटल पैथोलॉजी में मात्रात्मक ऊतक विश्लेषण के लिए ऐसा ही एक छवि विश्लेषण मंच है। इसमें विभिन्न मॉड्यूल शामिल हैं और पैटर्न मान्यता एल्गोरिदम का उपयोग करके पूरे ऊतक वर्गों में सेल-बाय-सेल आधार पर रूपात्मक और मल्टीप्लेक्स अभिव्यक्ति डेटा की रिपोर्ट करते हैं। साइटोन्यूक्लियर एफएल मॉड्यूल नाभिक या साइटोप्लाज्म में फ्लोरोसेंट मार्कर की इम्यूनोफ्लोर्सेंट सकारात्मकता को मापता है। यह प्रत्येक मार्कर के लिए सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या की रिपोर्टिंग के लिए अनुमति देता है, और प्रत्येक कोशिका के लिए तीव्रता स्कोर। मॉड्यूल को व्यक्तिगत सेल आकार और तीव्रता माप प्रदान करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, हालांकि डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स के मात्राकरण के लिए इस सुविधा की आवश्यकता नहीं है।
इस अध्ययन का उद्देश्य इस विधि को निग्रल न्यूरोडिजेनरेशन8,9,10के पहले मान्य वायरल वेक्टर आधारित α-सिन चूहा मॉडल के साथ सत्यापित करना है। इस मॉडल में, मानव उत्परिवर्ती A53T α-syn Adeno से जुड़े वायरस हाइब्रिड सेरोटाइप 1/2 (AAV1/2) के स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन द्वारा SNpc में व्यक्त किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप 6 सप्ताह की अवधि में महत्वपूर्ण न्यूरोडिजेनरेशन होता है । कॉन्ट्रालेट्रल यूनिजेनेक्टेड एसएनपीसी, कुछ अध्ययनों में, इंजेक्शन पक्ष के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में काम कर सकता है। अधिक सामान्यतः, जानवरों के नियंत्रण पलटन में एएवी-खाली वेक्टर (एएवी-ईवी) के इंजेक्शन का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता है। हम एक स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर(चित्रा 1)का उपयोग करके 6 सप्ताह के बाद इंजेक्शन एसएनपीसी में शेष डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स के घनत्व का अनुमान लगाने के लिए एक कदम-दर-कदम गाइड प्रस्तुत करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
पीडी के पूर्व-नैदानिक मॉडलों में डोपामिनेर्गिक प्रणाली की अखंडता का विश्वसनीय मूल्यांकन संभावित रोग-संशोधित चिकित्सा की प्रभावशीलता निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, संभावित कॉन्फाउंड ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस प्रोटोकॉल को विकसित करने में अपने समय और सहायता के लिए विश्वविद्यालय स्वास्थ्य नेटवर्क में उन्नत ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी सुविधा (एओएमएफ) में सभी कर्मचारियों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।
Materials
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
References
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