여기서, 우리는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) RNA를 시각화하기 위하여 정시 혼성화 (RNA-FISH)와 면역형광에 있는 RNA 형광을 결합하는 간단한 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 단일 세포 수준에서 SARS-CoV-2 RNA 숙주 상호 작용의 분자 특성에 대한 이해를 증가시킬 수 있다.
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이 논문에서
요약
초록
본 원고는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) RNA를 인간 기도 상피의 3차원(3D) 배양으로 시각화하기 위해 면역형광과 결합된 시상 혼성화 연쇄 반응(HCR)에서 프로토콜을 제공한다. 이 방법은 프로브 국소화에 의해 시작된 HCR에 의존하여 바이러스 RNA의 매우 구체적이고 민감한 시각화를 허용합니다. 분할 시이터 프로브는 형광으로 표지된 증폭기로 신호를 증폭시켜 공초점 현미경 검사법의 무시할 수 있는 배경 형광을 초래합니다. 다양한 형광염료를 가진 앰프를 라벨링하면 다양한 표적을 동시에 인식할 수 있습니다. 이것은, 차례차례로, 단세포 수준에서 바이러스성 병인 및 복제를 더 잘 이해하기 위하여 조직에 있는 감염의 매핑을 허용합니다. 면역 형광과 이 방법을 결합하면 숙주 후성 유전체 및 면역 반응 경로의 교대를 포함하여 숙주 바이러스 상호 작용에 대한 더 나은 이해를 촉진 할 수 있습니다. 민감하고 구체적인 HCR 기술 덕분에 이 프로토콜을 진단 도구로도 사용할 수 있습니다. 또한 미래에 나타날 수 있는 비코딩 RNA 및 RNA 바이러스를 포함하여 임의의 RNA의 검출을 가능하게 하기 위하여 기술이 쉽게 수정될 수 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
서론
SARS-CoV-2는 2019년 말에 등장한 새로운 인간 베타코로나바이러스로, 몇 달 후 전례 없는 전염병을 일으켰습니다. 바이러스는 과학에 새로운 때문에, 그것의 생물학및 호스트 세포에 그것의 충격의 대부분은 알려지지 않은 남아 있습니다. 따라서, 감염 시 바이러스 세포 및 조직 트트로피를 매핑하는 것은 그것의 기본적인 생물학적 특성 및 호스트에 대한 그 효력이 이해되어야 하는 경우에 중요합니다. 몇몇 기술은 생화학, 생물학 및 물리적 분석을 포함하여 바이러스 호스트 상호 작용을 검토하기 위하여 이용됩니다. 시상 혼성화는 세포 또는 조직에서 특정 DNA 또는 RNA 서열에 국한되는 표지된 상보DNA, RNA 또는 변형된 핵산 프로브를 사용하는 일반적인 방법입니다.
신분 혼성화(RNA-FISH) 방법의 새로운 RNA 형광은 HCR1을통해 신호 대 잡음 비율을 증폭시킴으로써 감도를 높이기 위한 변형을 통합하는 것으로 개발되었다. HCR은 단세포 수준에서 RNA 현지화의 연구를 허용합니다. 높은 특이성, 감도 및 해상도로 인해 이 방법은 기초 과학 연구뿐만 아니라 진단과 같은 적용 프로젝트에도 유용합니다. 최근에는, 본 방법의 타당성은 완전히 분화된 3D 인간기도 상피(HAE) 배양
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프로토콜
1. 버퍼 준비
- 2x PHEM 버퍼500mL의 경우 18.14 g의 파이프라진-N,N,N-bis(2-에탄설포닉산) (파이프S), 6.5 g4-(2-하이드록예트)를 결합합니다. hyl)-1-파이프라진 에탄 에탄황포닉산(HEPES), 에틸렌 글리콜 테트라아세산(EGTA), 황산 마그네슘 0.99g(MgSO4). 증류수(dH2O)로최대 ~400mL의 부피를 만들고, 수산화칼륨(KOH) 또는 수산화나트륨(NaOH)을 사용하여 pH를 7.0으로 조정한다. 최종 볼륨을 최대 500mL로 한 다음 50mL 알리쿼트로 분할합니다. 필요할 때까지 -20°C에 보관하십시오.
참고: pH가 7.0에 도달할 때까지 버퍼가 명확하지 않습니다. - /v 파라포름데히드(PFA)를 37% 순매수한다. 50mL의 경우 18.5g의 PFA와 35mL의 dH2O를 유리 병에 섞는다. 가열마그네틱 교반기 위에 병을 놓습니다. 1M KOH 또는 NaOH의 900 μL을 추가하고 용액이 명확해질 때까지 저어줍니다. 식히고 50mL 원심분리기 튜브로 이송할 수 있습니다. dH2O로 최대 50mL를 차지합니다. 용액은 필요할 때까지 -20 °C에서 저장할 수 있습니다.
참고: 포름알데히드는 보호 장....
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결과
본 원고에 기재된 면역-RNA-FISH 프로토콜은 베로 세포주 및 3D HAE 배양이라는 두 가지 세포 시스템을 사용하여 수행되었다. 두 셀룰러 모델의 주요 단계는 표 2에표시됩니다. HAE 배양에서 SARS-CoV-2의 시각화를 위한 RNA-FISH 프로토콜에는 조직 샘플, 즉 100% MeOH를 통한 투과성 및 0.1% Tween 솔루션을 통한 재수화를 위한 단계가 포함됩니다. 면역형광은 RNA-FISH가 완료된 후에 수행되었다. Zstack 이미지를 획득하여 처리했습니다.
도 1은 SARS-CoV-2에 감염된 모의 접종 조절 베로 세포 또는 세포에서 면역 RNA FISH를 나타낸다. 도 2는 SARS-CoV-2에 감염된 모.......
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토론
면역 RNA-FISH는 RNA 와 세포 단백질의 이중 염색을 위한 신뢰할 수 있는 방법입니다. 여기서, 변형된 면역-RNA-FISH 프로토콜은 세포주 및 HAE 배양에서 SARS-CoV-2 RNA 및 세포단백질의 검출을 가능하게 하는 것으로 기술되었다. 이 프로토콜은 세포 단층 또는 특정 조직을 포함하는 다른 세포 모형에서 사용하기 위하여 적응될 수 있습니다. 이 방법은 적절한 프로브 현지화로 시작된 HCR의 개념에 의존합니다. 다음으로, 형광 표지 증폭기에 의한 신호증폭을 시작하기 위한 분할 개시기 프로브를 사용하면 공초점 현미경을 사용하여 관찰될 때 최소한의 배경 형광을 초래한다. 앰프는 서로 다른 형광 염료로 표지될 수 있으며 다양한 표적을 인식하도록 설계된 다른 프로브와 호환됩니다. 따라서 동시에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에 설명된 절차는 간단하지만 시간이 많이 소요됩니다(3-4일). 그럼에도 불구하고, 결과는 직접 표지형 형광 프로브를 사용하는 다른 프로토콜과 달리 낮은 노이즈 대 신호 비율을 특징으로합니다.
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공개 사항
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 SARS-CoV-2에 대한 연구를 위해 과학 고등 교육부에 의해 지원되었으며 국립 과학 센터 (UMO2017/27 /B / NZ6 /02488에서 K.P.와 UMO-2018/E/NZ1/00874 ~ A.K.K.P.의 보조금)을 지원했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 장비 | |||
| 컨포칼 현미경 LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio, Mini Rocker- Shaker | Fisher Scientific | 12965501 | |
| Incubator Galaxy170R | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| 소스 | |||
| 15 mm x 15 mm NO. 1 커버슬립 | LabSolute | 7695022 | |
| 1.5 mL 튜브 | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| 12웰 플레이트 | TTP | 92412 | |
| 원추형 원심분리기 튜브 | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| 파라필름 | Sigma | P7793-1EA | |
| 혈청학 피펫 | VWR 컬렉션 | 612-5523P, 612-5827P | |
| 슬라이드 유리 | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts | Grainer 바이오-원 | 665641 | |
| 시약 | |||
| Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies | Invitrogen | ||
| β 5-튜불린 | 산타크루즈 생명공학 | sc-134234 | |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| 인산이나트륨 | 시그마 | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR 증폭 완충액 | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | 버퍼도 준비할 수 있습니다 doi:10.1242/dev.165753: 보충 정보 |
| HCR 증폭기 B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | ||
| HCR 증폭기 B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | ||
| HCR 프로브 혼성화 버퍼 | 분자 기기, Inc. | BPH03821 | 버퍼도 준비할 수 있습니다 doi:10.1242/dev.165753: |
| SARS-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc | PRE134 | |
| HCR 프로브 세척 버퍼 | 분자 기기, Inc. | BPW01522 | 버퍼도 준비 할 수 있습니다 doi : 10.1242 / dev.165753 : 추가 정보 |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| 황산 마그네슘 헵타 하이드레이트 | 시그마 | 63138-250G | |
| 메탄올 | 시그마 | 32213-1L-M | |
| 인산 일 칼륨 | 시그마 | P5655-100G | |
| 파라 포름 알데히드 | 시그마 | P6148-1KG | |
| 파이프 | BioShop | PIP666.100 | |
| 염화칼 | 시그마 | P5405-250G | |
| Prolong Diamond Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36970 | |
| 염화나트륨 | BioShop | SOD001.5 | |
| 구연산 삼나트륨 2-수화물 | POCH | 6132-04-3 | |
| Tween-20 | BioShop | TWN580.500 | |
| Software | |||
| Fluorescence Spectraviewer | 스펙트럼 매개변수 모델링 | ||
| ImageJ Fiji | z-stack 이미지 수집 및 처리 |
참고문헌
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
- Milewska, A., et al.
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재인쇄 및 허가
