تصور سارس-CoV-2 باستخدام الحمض النووي الريبي المناعي-فلورسينس في التهجين في الموقع
Summary
هنا، ونحن نصف طريقة بسيطة تجمع بين مضان الحمض النووي الريبي في التهجين الموقعي (RNA-FISH) مع immunofluorescence لتصور الفيروس التاجي متلازمة الجهاز التنفسي الحاد الوخيمة 2 (سارس-CoV-2) الجيش الملكي النيبالي. وقد يزيد هذا البروتوكول من فهم الخصائص الجزيئية للتفاعلات بين سارس وكاف-2 التي تستضيف الحمض النووي الريبي على مستوى الخلية الواحدة.
Abstract
توفر هذه المخطوطة بروتوكولا لسلسلة التفاعل التهجين في الموقع (HCR) إلى جانب الفلورة المناعية لتصور الفيروس التاجي للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة 2 (SARS-CoV-2) الحمض النووي الريبي في ثقافات خط الخلية والثقافات ثلاثية الأبعاد (3D) لظهارة مجرى الهواء البشري. تسمح هذه الطريقة بتصور محدد وحساس للغاية للجيش الملكي النيبالي الفيروسي من خلال الاعتماد على HCR الذي بدأه تعريب المسبار. تساعد المسابير المنقسمة على تضخيم الإشارة عن طريق مكبرات الصوت ذات العلامات الفلورية ، مما يؤدي إلى تفلور الخلفية لا يذكر في المجهر الكونفوكوكال. يسهل وضع العلامات على مكبرات الصوت ذات الأصباغ الفلورية المختلفة التعرف المتزامن على الأهداف المختلفة. وهذا بدوره يسمح لرسم خرائط العدوى في الأنسجة لفهم أفضل الإمراض الفيروسي والنسخ المتماثل على مستوى الخلية الواحدة. وقد يسهل اقتران هذه الطريقة بفلورية المناعة فهما أفضل للتفاعلات بين الفيروس المضيف، بما في ذلك تناوب مسارات الإبجينوم المضيف والاستجابة المناعية. ونظرا لتكنولوجيا HCR الحساسة والمحددة، يمكن استخدام هذا البروتوكول أيضا كأداة تشخيصية. ومن المهم أيضا أن نتذكر أن هذه التقنية يمكن تعديلها بسهولة لتمكين الكشف عن أي الحمض النووي الريبي، بما في ذلك الحمض النووي الريبي غير الترميز والفيروسات الحمض النووي الريبي التي قد تظهر في المستقبل.
Introduction
سارس-كوف-2 هو فيروس بيتاكورونا بشري جديد ظهر في نهاية عام 2019، مما تسبب في وباء غير مسبوق بعد بضعة أشهر. ولأن الفيروس جديد على العلم، فإن الكثير من بيولوجياته وتأثيره على الخلايا المضيفة لا يزالان غير معروفين. ولذلك، فإن رسم خرائط لخلايا الفيروس والأنسجة أثناء العدوى أمر مهم إذا كان لخصائصه البيولوجية الأساسية وآثاره على المضيف أن تفهم. وتستخدم عدة تقنيات لفحص التفاعل بين الفيروس المضيف بما في ذلك البيوكيميائية والبيولوجية والفيزيائية. التهجين في الموقع هو طريقة شائعة تستخدم الحمض النووي التكميلي المسمى ، الحمض النووي الريبي ، أو مسابير الحمض النووي المعدلة ، والتي يتم توطينها على تسلسل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي المحدد في خلية أو نسيج.
تم تطوير طريقة جديدة للفلورسنت RNA في الموقع (RNA-FISH) تتضمن تعديلات لزيادة الحساسية من خلال تضخيم نسبة الإشارة إلى الضوضاء عبر HCR1. يسمح HCR بدراسة توطين الحمض النووي الريبي على مستوى الخلية الواحدة. ونظرا لخصوصية هذه الطريقة وحساسيتها وحلها، فإنها مفيدة ليس فقط للدراسات العلمية الأساسية، ولكن أيضا للمشاريع التطبيقية، مثل التشخيص. في الآونة الأخيرة ، تم إثبات جدوى هذه الطريقة للكشف عن سارس -CoV-2 RNA المترجمة إلى خلايا مهتحلة داخل ظهارة مجرى الهواء البشري ثلاثي الأبعاد (HAE)الثقافات 2. تشكل ثقافات HAE واحدة من أكثر الأدوات تقدما المستخدمة لدراسة العدوى الفيروسية في سياق “العدوى الطبيعية” البيئة الدقيقة3،4.
العديد من التقارير عن الفيروسات التاجية البشرية (HCoV)، بما في ذلك سارس-CoV-2، تسلط الضوء على أهمية التعديلات اللاجينية فيما يتعلق بعدوى فيروس التهاب الكبد HCoV والفيزيولوجيا المرضية [تمت مراجعتها في 5]،على سبيل المثال، نمط ميثيل الجين ترميز الانزيم المحول الأنجيوتنسين 2 (ACE-2) مستقبلات6،7. ومن المثير للاهتمام أن الفحص الطيفي الشامل حدد العديد من العوامل اللاجينية التي تتفاعل مع بروتيوم سارس-كوف-28. وبشكل أكثر تحديدا، يرتبط البروتين غير الهيكلي 5 (NSP5) بمنظم اللاجينية، وهستون دي اسيتيلاسي 2، ويتفاعل NSP5 غير النشط بشكل تحفيزي (C145A) مع ميثيل ترانسفيراسي TRNA 1 (24). بالإضافة إلى ذلك، يتم حظر نشاط ميثيل ترانسفيراز NSP16 بواسطة مثبط ميثيل ترانسفيراز، سينيفونجين9. ومع ذلك، لا يزال الدور الدقيق لهذه العوامل اللاجينية في COVID-19 غير واضح. يحدث تكرار فيروس التهاب الكبد في السيتوبلازم للخلية المصابة ، ويثير استجابات التهابية تنظمها تعديلات لا جينية10.
على سبيل المثال، HCoV-229E غرامة الإيقاعات النووية عامل كابا B الإشارات وإعادة برمجة عميقة المشهد الكروماتين الخلوية المضيفة عن طريق زيادة أسيتيل H3K36 و H4K5 في مناطق معينة11. تزيد عدوى الفيروس التاجي المرتبطة بمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية من مستويات H3K27me3 وتستنفد H3K4me3 في المناطق المروجة للمجموعات الفرعية من جينات محددة حساسة للإنترفيرون12. بالإضافة إلى ذلك، RNA الفيروسية مشغلات الاستجابات المناعية الخلية، كما هو موضح لflviviruses13،الفيروساتالرجعية 14،15،والفيروسات التاجية16. علامات اللاجينية على الحمض النووي الريبي الفيروسي قد تلعب دورا في الاعتراف من قبل أجهزة الاستشعار الخلوية, كما هو مبين لمثيلة M7A من فيروس نقص المناعة البشرية-1 RNA17. ومع ذلك، لا تزال هناك أسئلة: ما هو تأثير السارس-CoV-2 RNA على الاستجابة المناعية، وما هي العلامات اللاجينية المعنية؟
هنا، تم وصف طريقة محسنة RNA-FISH مقرونة بتحليل immunofluorescence لخطوط الخلايا والأنسجة ثلاثية الأبعاد (HAE متباينة تماما). على الرغم من أن الأساليب الخلوية، مثل FISH و immunofluorescence، تستخدم على نطاق واسع، فإن هذا الجيل الجديد من طريقة التهجين في الموقع على أساس HCR لم يستخدم أبدا للكشف عن الفيروسات (إلا في منشور حديث)2. بشكل عام، يتطلب الاحتواء المناعي والسمك الخطوات التالية: البيرمابيلينج لتمكين اختراق المسابير أو الأجسام المضادة؛ والنفاذ إلى الأجسام المضادة؛ والنفاذ إلى الأجسام المضادة؛ والاختراق في الأجسام المضادة؛ التثبيت الذي يتم فيه إصلاح المواد الخلوية والحفاظ عليها؛ الكشف عن الأجسام المضادة أو مسابير الحمض النووي التي يتم تطبيقها؛ وأخيرا ، تركيب عينات للتصور.
وعلى الرغم من أن البروتوكولات الموجودة تشترك في هذه الميزات العامة، فإنها تختلف اختلافا ملحوظا فيما يتعلق بالمعلمات المعنية. هنا، تم وصف بروتوكول محسن وبسيط ومناعي RNA-FISH للكشف عن سارس-كوف-2 الحمض النووي الريبي في ثقافات HAE وخلايا فيرو. وتتألف هذه التقنية من الخطوات التالية: (1) تثبيت الخلايا بالبارافورمالديهايد؛ (2) تثبيت الخلايا بالبارافورمالديهايد؛ (2) تثبيت الخلايا مع الخلايا ذات الخلايا الخافية؛ (2) تثبيت الخلايا بالخلايا ذات الخلايا اللولبة؛ ( (2) البيرميلات باستخدام المنظفات أو الميثانول (MeOH)؛ (3) الإماهة من خلال سلسلة متدرج من حلول MeOH (ثقافات HAE فقط)؛ (4) الكشف؛ (5) التضخيم باستخدام تكنولوجيا HCR للكشف عن الحمض النووي الريبي سارس-CoV-2؛ (6) اللطغى المناعي؛ و (7) التصوير تحت المجهر confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immuno-RNA-FISH هو طريقة موثوقة لتلطيخ الحمض النووي الريبي والبروتينات الخلوية. هنا، تم وصف بروتوكول معدل مناعي الحمض النووي الريبي-FISH يسمح بالكشف عن الحمض النووي الريبي سارس-كوف-2 والبروتينات الخلوية في خطوط الخلايا وثقافات HAE. يمكن تكييف هذا البروتوكول للاستخدام في نماذج الخلايا المختلفة بما ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت وزارة العلوم والتعليم العالي هذا العمل في مجال البحوث المتعلقة بالسارس-CoV-2، ومنح من المركز الوطني للعلوم (المنح UMO2017/27/B/NZ6/02488 إلى K.P. وUMO-2018/30/E/NZ1/00874 إلى A.K.-P.).
Materials
| Equipment | |||
| Confocal Microscope LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio, Mini Rocker- Shaker | Fisher Scientific | 12965501 | |
| Incubator Galaxy170R | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| Materials | |||
| 15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips | LabSolute | 7695022 | |
| 1.5 mL tubes | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| 12-well plate | TTP | 92412 | |
| Conical centrifuge tube | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| serological pipets | VWR Collection | 612-5523P, 612-5827P | |
| slide glass | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts | Grainer bio-one | 665641 | |
| Reagents | |||
| Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies | Invitrogen | ||
| β5-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | sc-134234 | |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| Disodium phosphate | Sigma | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR Amplification Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S013922 | |
| HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S012522 | |
| HCR Probe Hybridization Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
| HCR Probe Wash Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methanol | Sigma | 32213-1L-M | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655-100G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| PIPES | BioShop | PIP666.100 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P5405-250G | |
| Prolong Diamond Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36970 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.5 | |
| Trisodium Citrate 2-hydrate | POCH | 6132-04-3 | |
| Tween-20 | BioShop | TWN580.500 | |
| Software | |||
| Fluorescence Spectraviewer | Modeling spectral parameters | ||
| ImageJ Fiji | Acquiring and processing z-stack images |
References
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
- Milewska, A., et al. Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium. Journal of Virology. 94, (2020).
- Banach, B. S., et al. Human airway epithelial cell culture to identify new respiratory viruses: coronavirus NL63 as a model. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 19-26 (2009).
- Milewska, A., et al. Entry of human coronavirus NL63 into the cell. Journal of Virology. 92, (2018).
- El Baba, R., Herbein, G. Management of epigenomic networks entailed in coronavirus infections and COVID-19. Clinical Epigenetics. 12, 118 (2020).
- Pinto, B. G. G., et al. ACE2 expression is increased in the lungs of patients with comorbidities associated with severe COVID-19. Journal of Infectious Diseases. 222 (4), 556-563 (2020).
- Verdecchia, P., Cavallini, C., Spanevello, A., Angeli, F. The pivotal link between ACE2 deficiency and SARS-CoV-2 infection. European Journal of Internal Medicine. 76, 14-20 (2020).
- Gordon, D. E., et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature. 583, 459-468 (2020).
- Ferron, F., Decroly, E., Selisko, B., Canard, B. The viral RNA capping machinery as a target for antiviral drugs. Antiviral Research. 96 (1), 21-31 (2012).
- Mehta, S., Jeffrey, K. L. Beyond receptors and signaling: epigenetic factors in the regulation of innate immunity. Immunology and Cell Biology. 93 (3), 233-244 (2015).
- Poppe, M., et al. The NF-kappaB-dependent and -independent transcriptome and chromatin landscapes of human coronavirus 229E-infected cells. PLoS Pathogens. 13, 1006286 (2017).
- Schafer, A., Baric, R. S. Epigenetic landscape during coronavirus infection. Pathogens. 6 (1), 8 (2017).
- Carletti, T., et al. Viral priming of cell intrinsic innate antiviral signaling by the unfolded protein response. Nature Communications. 10, 3889 (2019).
- Heil, F., et al. Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science. 303 (5663), 1526-1529 (2004).
- Sze, A., et al. Host restriction factor SAMHD1 limits human T cell leukemia virus type 1 infection of monocytes via STING-mediated apoptosis. Cell Host and Microbe. 14 (4), 422-434 (2013).
- Kikkert, M. Innate immune evasion by human respiratory RNA viruses. Journal of Innate Immunity. 12, 4-20 (2020).
- Kennedy, E. M., et al. Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression. Cell Host and Microbe. 22 (6), 830 (2017).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
- Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. Visualizing coronavirus entry into cells. Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).
