使用免疫RNA-荧光原位杂交对SARS-CoV-2进行可视化
Summary
在这里，我们描述了一个简单的方法，结合RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）与免疫荧光可视化严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2）RNA。该协议可以增加对SARS-CoV-2 RNA-主机在单细胞水平上的分子特征的理解。
Abstract
本手稿提供了原位杂交链反应 （HCR） 与免疫荧光的协议，可直观地将严重急性呼吸系统综合征冠状病毒 2 （SARS-CoV-2） RNA 在细胞系中和人类气道上皮的三维 （3D） 培养物中。该方法允许高度具体和敏感的病毒RNA可视化，依靠HCR启动的探针本地化。拆分启动器探头通过荧光标记的放大器帮助放大信号，导致共焦显微镜中可忽略不计的背景荧光。用不同的荧光染料标记放大器有助于同时识别各种目标。这反过来又使组织中的感染图谱能够更好地了解单细胞水平的病毒发病机能和复制。将这种方法与免疫荧光相结合，可以促进更好地了解宿主-病毒相互作用，包括宿主表观基因组和免疫反应通路的交替。由于敏感和特定的HCR技术，此协议也可以用作诊断工具。同样重要的是要记住，该技术可能很容易修改，以便能够检测任何RNA，包括将来可能出现的非编码RNA和RNA病毒。
Introduction
SARS-CoV-2是一种新型的人类β可罗纳病毒，于2019年底出现，几个月后引发了前所未有的大流行。由于该病毒是科学的新生病毒，因此其大部分生物学及其对宿主细胞的影响仍不得而知。因此，如果要了解病毒细胞和组织在感染过程中的三胞头，其基本的生物学特征及其对宿主的影响就很重要。使用多种技术来检查病毒宿主之间的相互作用，包括生化、生物和物理检测。原位杂交是一种常用方法，它采用标记的互补DNA、RNA或改性核酸探针，该探针定位到细胞或组织中的特定DNA或RNA序列。
一种新的RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）方法已经开发出来，它结合了修改，通过HCR1放大信号与噪声比来增加灵敏度。HCR 允许在单细胞级别上研究 RNA 本地化。由于其特异性、灵敏度和分辨率高，这种方法不仅对基础科学研究有用，而且对应用项目（如诊断）也很有用。最近，该方法的可行性被证明用于检测SARS-CoV-2RNA本地化为完全分化的3D人类气道上皮（HAE）培养物2中的附属细胞。HAE文化是用于研究”自然感染”微环境3、4背景下病毒感染的最先进工具之一。
包括SARS-CoV-2在内的几份关于人类冠状病毒（HCoV）的报告强调了表观遗传学对HCoV感染和病理生理学（在5中回顾）的重要性，例如编码血管紧张素转换酶2（ACE-2）受体6、7的基因的甲基化模式。有趣的是，质谱筛查发现了几个与SARS-CoV-2蛋白体8相互作用的表观遗传因素。更具体地说，非结构蛋白 5 （NSP5） 与表观遗传调节器、高石脱乙酰酶 2 结合，催化不活跃 NSP5 （C145A） 与 tRNA 甲基转移酶 1 （24） 相互作用。此外，NSP16甲基转移酶活性被甲基转移酶抑制剂西内芬金9阻断。然而，这些表观遗传因素在COVID-19中的确切作用尚不清楚。HCoV的复制发生在受感染细胞的细胞质中，并触发由表观遗传修饰调节的炎症反应10。
例如，HCoV-229E微调核因子-卡帕B信号，并通过在某些区域增加H3K36和H4K5的乙酰化，对宿主细胞色度图进行深刻重新编程。中东呼吸系统综合症相关冠状病毒感染增加了H3K27me3的水平，并耗尽了H3K4me3在特定干扰素敏感基因12子集的促进区域。此外，病毒RNA触发细胞免疫反应，如病毒13，逆转录病毒14，15和冠状病毒16证明。病毒RNA上的表观遗传标记可能起到细胞传感器识别的作用，如人类免疫缺陷病毒-1 RNA17的m7A甲基化所示。然而，问题依然存在：SARS-CoV-2RNA对免疫反应有何影响，是否涉及表观遗传标记？
在这里，介绍了一种优化的RNA-FISH方法，以及细胞系和3D组织（完全分化HAE）的免疫荧光分析。虽然细胞学方法，如FISH和免疫荧光，被广泛使用，这种基于HCR的新一代原位杂交方法从未用于病毒检测（除了在最近的出版物）2。一般来说，免疫染色和鱼氧化物需要以下步骤：渗透，使探针或抗体穿透：固定其中细胞材料固定和保存;检测其中应用抗体或核酸探针;最后，安装样品进行可视化。
虽然现有协议具有这些通用功能，但它们在所涉及的参数方面存在显著差异。在这里，一个优化的，简单的，免疫-RNA-FISH协议已经描述检测SARS-CoV-2RNA在HAE培养和维罗细胞。该技术包括以下步骤：（1） 用甲醛固定细胞：（2） 用洗涤剂或甲醇（MeOH） 渗透：（3） 通过一系列分级的 MeOH 解决方案（仅限 HAE 文化）进行补液：（4） 检测：（五）利用HCR技术检测SARS-CoV-2RNA的放大：（六）免疫学：和（7）在共焦显微镜下成像。
Protocol
Representative Results
Discussion
免疫-RNA-FISH是RNA和细胞蛋白双重染色的可靠方法。在这里，描述了一个经过修改的免疫-RNA-FISH协议，允许检测SARS-CoV-2RNA和细胞蛋白的细胞系和HAE培养物。此协议可适用于不同的细胞模型，包括细胞单层或特定组织。该方法依赖于由适当的探头本地化启动的HCR的概念。接下来，使用分发启动器探头开始放大荧光标记放大器的信号，当使用共聚焦显微镜观察时，可产生极小到无背景荧光。放大器可以…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了科学和高等教育部对SARS-CoV-2研究的支持，并得到了国家科学中心的赠款（向K.P.和UMO-2018/30/E/NZ1/00874赠款给A.K.-P.）。
Materials
| Equipment | |||
| Confocal Microscope LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio, Mini Rocker- Shaker | Fisher Scientific | 12965501 | |
| Incubator Galaxy170R | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| Materials | |||
| 15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips | LabSolute | 7695022 | |
| 1.5 mL tubes | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| 12-well plate | TTP | 92412 | |
| Conical centrifuge tube | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| serological pipets | VWR Collection | 612-5523P, 612-5827P | |
| slide glass | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts | Grainer bio-one | 665641 | |
| Reagents | |||
| Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies | Invitrogen | ||
| β5-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | sc-134234 | |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| Disodium phosphate | Sigma | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR Amplification Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S013922 | |
| HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S012522 | |
| HCR Probe Hybridization Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
| HCR Probe Wash Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methanol | Sigma | 32213-1L-M | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655-100G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| PIPES | BioShop | PIP666.100 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P5405-250G | |
| Prolong Diamond Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36970 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.5 | |
| Trisodium Citrate 2-hydrate | POCH | 6132-04-3 | |
| Tween-20 | BioShop | TWN580.500 | |
| Software | |||
| Fluorescence Spectraviewer | Modeling spectral parameters | ||
| ImageJ Fiji | Acquiring and processing z-stack images |
References
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