Visualisation du SARS-CoV-2 à l’aide de l’hybridation in situ par immuno-ARN-fluorescence
Summary
Ici, nous décrivons une méthode simple qui combine l’hybridation in situ de fluorescence d’ARN (ARN-POISSON) avec l’immunofluorescence pour visualiser l’ARN du coronavirus 2 (SARS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère. Ce protocole peut améliorer la compréhension des caractéristiques moléculaires des interactions ARN-hôte du SARS-CoV-2 au niveau unicellulaire.
Abstract
Ce manuscrit fournit un protocole pour l’hybridation in situ de la réaction en chaîne (HCR) couplée à l’immunofluorescence pour visualiser l’ARN du coronavirus 2 (SARS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère dans la lignée cellulaire et les cultures tridimensionnelles (3D) de l’épithélium des voies respiratoires humaines. La méthode permet une visualisation très spécifique et sensible de l’ARN viral en s’appuyant sur HCR initié par la localisation de sonde. Les sondes à initiateurs fendus aident à amplifier le signal par des amplificateurs marqués par fluorescence fluorescente, ce qui entraîne une fluorescence de fond négligeable en microscopie confocale. Le étiquetage des amplificateurs avec différents colorants fluorescents facilite la reconnaissance simultanée de diverses cibles. Ceci, à son tour, permet la cartographie de l’infection dans les tissus pour mieux comprendre la pathogenèse virale et la réplication au niveau unicellulaire. Le couplage de cette méthode avec l’immunofluorescence peut faciliter une meilleure compréhension des interactions hôte-virus, y compris l’alternance de l’épigénome de l’hôte et des voies de réponse immunitaire. Grâce à une technologie HCR sensible et spécifique, ce protocole peut également être utilisé comme outil de diagnostic. Il est également important de se rappeler que la technique peut être modifiée facilement pour permettre la détection de tout ARN, y compris les ARN non codants et les virus à ARN qui pourraient émerger à l’avenir.
Introduction
Le SARS-CoV-2 est un nouveau bêtacoronavirus humain apparu fin 2019, provoquant une pandémie sans précédent quelques mois plus tard. Parce que le virus est nouveau pour la science, une grande partie de sa biologie et de son impact sur les cellules hôtes restent inconnus. Par conséquent, la cartographie du tropisme des cellules virales et des tissus pendant l’infection est importante si l’on veut comprendre ses caractéristiques biologiques de base et ses effets sur l’hôte. Plusieurs techniques sont utilisées pour examiner l’interaction virus-hôte, y compris les essais biochimiques, biologiques et physiques. L’hybridation in situ est une méthode courante qui utilise des sondes d’ADN, d’ARN ou d’acides nucléiques modifiés complémentaires marqués, qui se localisent à des séquences d’ADN ou d’ARN spécifiques dans une cellule ou un tissu.
Une nouvelle méthode d’hybridation in situ fluorescente de l’ARN (ARN-FISH) a été développée qui intègre des modifications pour augmenter la sensibilité en amplifiant le rapport signal/bruit via un HCR1. HCR permet l’étude de la localisation de l’ARN au niveau unicellulaire. En raison de sa grande spécificité, sensibilité et résolution, cette méthode est utile non seulement pour les études scientifiques fondamentales, mais aussi pour les projets applicatifs, par exemple, le diagnostic. Récemment, la faisabilité de cette méthode a été démontrée pour détecter l’ARN du SARS-CoV-2 localisé sur des cellules ciliées dans des cultures 3D entièrement différenciées de l’épithélium des voies respiratoires humaines (AH)2. Les cultures d’AHH constituent l’un des outils les plus avancés utilisés pour étudier l’infection virale dans le contexte du microenvironnement « infection naturelle »3,4.
Plusieurs rapports sur les coronavirus humains (HCoV), y compris le SARS-CoV-2, soulignent l’importance des modifications épigénétiques en ce qui concerne l’infection à HCoV et la physiopathologie [examinés en 5],par exemple, le modèle de méthylation du gène codant pour le récepteur 6 de l’enzyme de conversion de l’angiotensine2 (ACE-2) 6,7. Fait intéressant, le criblage par spectrométrie de masse a identifié plusieurs facteurs épigénétiques qui interagissent avec le protéome du SARS-CoV-28. Plus précisément, la protéine non structurale 5 (NSP5) se lie au régulateur épigénétique, l’histone désacétylase 2, et la NSP5 catalytiquement inactive (C145A) interagit avec l’ARNt méthyltransférase 1 (24). De plus, l’activité de la méthyltransférase NSP16 est bloquée par l’inhibiteur de la méthyltransférase, la sinefungine9. Cependant, le rôle exact de ces facteurs épigénétiques dans la COVID-19 reste incertain. La réplication du HCoV a lieu dans le cytoplasme de la cellule infectée et déclenche des réponses inflammatoires régulées par des modifications épigénétiques10.
Par exemple, HCoV-229E affine la signalisation du facteur nucléaire-kappa B et reprogramme profondément le paysage de la chromatine cellulaire hôte en augmentant l’acétylation de H3K36 et H4K5 dans certaines régions11. L’infection à coronavirus liée au syndrome respiratoire du Moyen-Orient augmente les niveaux de H3K27me3 et épuise H3K4me3 dans les régions promotrices de sous-ensembles de gènes spécifiques sensibles à l’interféron12. De plus, l’ARN viral déclenche des réponses immunitaires cellulaires, comme démontré pour les flavivirus13,les rétrovirus14,15et les coronavirus16. Les marqueurs épigénétiques sur l’ARN viral peuvent jouer un rôle dans la reconnaissance par les capteurs cellulaires, comme le montre la méthylation m7A de l’ARN 17 du virus de l’immunodéficiencehumaine-1. Cependant, des questions demeurent : quel est l’impact de l’ARN du SARS-CoV-2 sur la réponse immunitaire, et les marques épigénétiques sont-elles impliquées ?
Ici, une méthode RNA-FISH optimisée couplée à l’analyse d’immunofluorescence des lignées cellulaires et des tissus 3D (AHS entièrement différencié) a été décrite. Bien que les méthodes cytologiques, telles que FISH et l’immunofluorescence, soient largement utilisées, cette méthode d’hybridation in situ de nouvelle génération basée sur HCR n’a jamais été utilisée pour la détection de virus (sauf dans une publication récente)2. En général, l’immunomarquage et le FISH nécessitent les étapes suivantes: perméabilisation pour permettre la pénétration de sondes ou d’anticorps; fixation dans laquelle le matériel cellulaire est fixé et préservé; détection dans laquelle des anticorps ou des sondes d’acides nucléiques sont appliqués; et enfin, le montage des échantillons pour la visualisation.
Bien que les protocoles existants partagent ces caractéristiques générales, ils varient considérablement en ce qui concerne les paramètres impliqués. Ici, un protocole immuno-ARN-FISH optimisé et simple a été décrit pour détecter l’ARN du SARS-CoV-2 dans les cultures d’AH et les cellules Vero. La technique comprend les étapes suivantes : (1) fixation des cellules avec du paraformaldéhyde ; 2° perméabilisation au détergent ou au méthanol (MeOH); (3) réhydratation par une série graduée de solutions de MeOH (cultures d’AOH seulement); 4° la détection; (5) amplification à l’aide de la technologie HCR pour détecter l’ARN du SARS-CoV-2; (6) immunomarquage ; et (7) imagerie sous un microscope confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immuno-RNA-FISH est une méthode fiable pour la double coloration de l’ARN et des protéines cellulaires. Ici, un protocole immuno-ARN-FISH modifié a été décrit qui permet la détection de l’ARN du SARS-CoV-2 et des protéines cellulaires dans les lignées cellulaires et les cultures d’AHH. Ce protocole peut être adapté pour une utilisation dans différents modèles cellulaires, y compris des monocouches cellulaires ou des tissus spécifiques. La méthode repose sur le concept d’un HCR initié par la locali…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le ministère des Sciences et de l’Enseignement supérieur pour la recherche sur le SARS-CoV-2, et par des subventions du Centre national des sciences (subventions UMO2017/27/B/NZ6/02488 à K.P. et UMO-2018/30/E/NZ1/00874 à A.K.-P.).
Materials
| Equipment | |||
| Confocal Microscope LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio, Mini Rocker- Shaker | Fisher Scientific | 12965501 | |
| Incubator Galaxy170R | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| Materials | |||
| 15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips | LabSolute | 7695022 | |
| 1.5 mL tubes | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| 12-well plate | TTP | 92412 | |
| Conical centrifuge tube | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| serological pipets | VWR Collection | 612-5523P, 612-5827P | |
| slide glass | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts | Grainer bio-one | 665641 | |
| Reagents | |||
| Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies | Invitrogen | ||
| β5-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | sc-134234 | |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| Disodium phosphate | Sigma | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR Amplification Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S013922 | |
| HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S012522 | |
| HCR Probe Hybridization Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
| HCR Probe Wash Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methanol | Sigma | 32213-1L-M | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655-100G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| PIPES | BioShop | PIP666.100 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P5405-250G | |
| Prolong Diamond Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36970 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.5 | |
| Trisodium Citrate 2-hydrate | POCH | 6132-04-3 | |
| Tween-20 | BioShop | TWN580.500 | |
| Software | |||
| Fluorescence Spectraviewer | Modeling spectral parameters | ||
| ImageJ Fiji | Acquiring and processing z-stack images |
References
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