Visualizzazione di SARS-CoV-2 utilizzando l'ibridazione immuno RNA-fluorescenza in situ
Summary
Qui descriviamo un metodo semplice che combina la fluorescenza dell’RNA nell’ibridazione situ (RNA-FISH) con l’immunofluorescenza per visualizzare l’RNA della sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Questo protocollo può aumentare la comprensione delle caratteristiche molecolari delle interazioni RNA-host SARS-CoV-2 a livello di singola cellula.
Abstract
Questo manoscritto fornisce un protocollo per la reazione a catena di ibridazione in situ (HCR) accoppiato con immunofluorescenza per visualizzare la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA in linea cellulare e colture tridimensionali (3D) dell’epitelio delle vie aeree umane. Il metodo consente una visualizzazione altamente specifica e sensibile dell’RNA virale affidandosi all’HCR avviato dalla localizzazione della sonda. Le sonde split-initiator aiutano ad amplificare il segnale con amplificatori etichettati fluorescentmente, con conseguente trascurabile fluorescenza di fondo nella microscopia confocale. L’etichettatura di amplificatori con diversi coloranti fluorescenti facilita il riconoscimento simultaneo di vari bersagli. Questo, a sua volta, consente la mappatura dell’infezione nei tessuti per comprendere meglio la patogenesi virale e la replicazione a livello di singola cellula. L’accoppiamento di questo metodo con l’immunofluorescenza può facilitare una migliore comprensione delle interazioni ospite-virus, compresa l’alternanza dell’epigenoma ospite e delle vie di risposta immunitaria. Grazie alla tecnologia HCR sensibile e specifica, questo protocollo può anche essere utilizzato come strumento diagnostico. È anche importante ricordare che la tecnica può essere modificata facilmente per consentire il rilevamento di qualsiasi RNA, inclusi gli RNA non codificanti e i virus dell’RNA che potrebbero emergere in futuro.
Introduction
SARS-CoV-2 è un nuovo betacoronavirus umano emerso alla fine del 2019, causando una pandemia senza precedenti pochi mesi dopo. Poiché il virus è nuovo per la scienza, gran parte della sua biologia e il suo impatto sulle cellule ospiti rimangono sconosciuti. Pertanto, la mappatura del tropismo virus-cellula e-tessuto durante l’infezione è importante se si vengono comprese le sue caratteristiche biologiche di base e i suoi effetti sull’ospite. Diverse tecniche sono utilizzate per esaminare l’interazione virus-ospite tra cui saggi biochimici, biologici e fisici. L’ibridazione in situ è un metodo comune che utilizza sonde di DNA, RNA o acido nucleico modificate etichettate, che si localizzano in specifiche sequenze di DNA o RNA in una cellula o tessuto.
È stato sviluppato un nuovo metodo di ibridazione in situ fluorescente RNA (RNA-FISH) che incorpora modifiche per aumentare la sensibilità amplificando il rapporto segnale-rumore tramite un HCR1. L’HCR consente lo studio della localizzazione dell’RNA a livello di singola cellula. Grazie alla sua elevata specificità, sensibilità e risoluzione, questo metodo è utile non solo per gli studi scientifici di base, ma anche per i progetti di applicatori, ad esempio la diagnostica. Recentemente, è stata dimostrata la fattibilità di questo metodo per rilevare l’RNA SARS-CoV-2 localizzato nelle cellule ciliate all’interno di colture di epitelio delle vie aeree umane 3D (HAE) completamente differenziate2. Le colture hae costituiscono uno degli strumenti più avanzati utilizzati per studiare l’infezione virale nel contesto del microambiente “infezionenaturale” 3,4.
Diversi rapporti sui coronavirus umani (HCoV), tra cui SARS-CoV-2, evidenziano l’importanza delle modifiche epigenetiche rispetto all’infezione da HCoV e alla fisiopatologia [recensito in 5], ad esempio il modello di metilazione del gene che codifica per il recettore dell’enzima di conversione dell’angiotensina 2 (ACE-2)6,7. È interessante notare che lo screening spettrometrico di massa ha identificato diversi fattori epigenetici che interagiscono con il proteoma SARS-CoV-28. Più specificamente, la proteina non strutturale 5 (NSP5) si lega al regolatore epigenetico, alla deacetilasi istonica 2 e l’NSP5 cataliticamente inattivo (C145A) interagisce con il tRNA metiltransferasi 1 (24). Inoltre, l’attività della metiltransferasi NSP16 è bloccata dall’inibitore della metiltransferasi, sinefungina9. Tuttavia, il ruolo esatto di questi fattori epigenetici nel COVID-19 rimane poco chiaro. La replicazione dell’HCoV avviene nel citoplasma della cellula infetta e innesca risposte infiammatorie regolate da modifiche epigenetiche10.
Ad esempio, HCoV-229E sintonizza finemente la segnalazione del fattore nucleare-kappa B e riprogramma profondamente il paesaggio della cromatina cellulare ospite aumentando l’acetilazione di H3K36 e H4K5 in alcune regioni11. L’infezione da coronavirus correlata alla sindrome respiratoria in Medio Oriente aumenta i livelli di H3K27me3 e esaurisce h3K4me3 nelle regioni promotrice di sottoinsiemi di specifici geni sensibili all’interferone12. Inoltre, l’RNA virale innesca risposte immunitarie cellulari, come dimostrato per flavivirus13,retrovirus 14,15e coronavirus16. I marcatori epigenetici sull’RNA virale possono svolgere un ruolo nel riconoscimento da parte dei sensori cellulari, come mostrato per la metilazione m7A del virus dell’immunodeficienza umana-1 RNA17. Tuttavia, rimangono domande: qual è l’impatto dell’RNA SARS-CoV-2 sulla risposta immunitaria e sono coinvolti segni epigenetici?
Qui è stato descritto un metodo RNA-FISH ottimizzato abbinato all’analisi dell’immunofluorescenza delle linee cellulari e dei tessuti 3D (HAE completamente differenziato). Sebbene i metodi citologici, come FISH e immunofluorescenza, siano ampiamente utilizzati, questo metodo di ibridazione in situ di nuova generazione basato sull’HCR non è mai stato utilizzato per il rilevamento di virus (tranne in una recente pubblicazione)2. In generale, l’immunostaining e il FISH richiedono i seguenti passaggi: permeabilizzazione per consentire la penetrazione di sonde o anticorpi; fissazione in cui il materiale cellulare è fissato e conservato; individuazione in cui vengono applicati anticorpi o sonde di acido nucleico; e infine, il montaggio dei campioni per la visualizzazione.
Sebbene i protocolli esistenti consevidano queste caratteristiche generali, variano notevolmente rispetto ai parametri coinvolti. Qui, è stato descritto un protocollo ottimizzato, semplice, immuno-RNA-FISH per rilevare l’RNA SARS-CoV-2 nelle colture HAE e nelle cellule Vero. La tecnica comprende i seguenti passaggi: (1) fissazione di cellule con paraformaldeide; 2) permeabilità con detergente o metanolo (MeOH); (3) reidratazione attraverso una serie graduata di soluzioni MeOH (solo colture HAE); 4) individuazione; (5) amplificazione mediante tecnologia HCR per rilevare l’RNA SARS-CoV-2; 6) immunosocienza; e (7) imaging al microscopio confocale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immuno-RNA-FISH è un metodo affidabile per la doppia colorazione di RNA e proteine cellulari. Qui è stato descritto un protocollo immuno-RNA-FISH modificato che consente il rilevamento di RNA SARS-CoV-2 e proteine cellulari nelle linee cellulari e nelle colture HAE. Questo protocollo può essere adattato per l’uso in diversi modelli cellulari tra cui monostrati cellulari o tessuti specifici. Il metodo si basa sul concetto di HCR avviato da una localizzazione del probe appropriata. Successivamente, l’uso di sonde split-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero della Scienza e dell’Istruzione Superiore per la ricerca sulla SARS-CoV-2 e da sovvenzioni del National Science Center (sovvenzioni UMO2017/27/B/NZ6/02488 a K.P. e UMO-2018/30/E/NZ1/00874 ad A.K.-P.).
Materials
| Equipment | |||
| Confocal Microscope LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio, Mini Rocker- Shaker | Fisher Scientific | 12965501 | |
| Incubator Galaxy170R | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| Materials | |||
| 15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips | LabSolute | 7695022 | |
| 1.5 mL tubes | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| 12-well plate | TTP | 92412 | |
| Conical centrifuge tube | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| serological pipets | VWR Collection | 612-5523P, 612-5827P | |
| slide glass | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts | Grainer bio-one | 665641 | |
| Reagents | |||
| Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies | Invitrogen | ||
| β5-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | sc-134234 | |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| Disodium phosphate | Sigma | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR Amplification Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S013922 | |
| HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S012522 | |
| HCR Probe Hybridization Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
| HCR Probe Wash Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methanol | Sigma | 32213-1L-M | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655-100G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| PIPES | BioShop | PIP666.100 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P5405-250G | |
| Prolong Diamond Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36970 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.5 | |
| Trisodium Citrate 2-hydrate | POCH | 6132-04-3 | |
| Tween-20 | BioShop | TWN580.500 | |
| Software | |||
| Fluorescence Spectraviewer | Modeling spectral parameters | ||
| ImageJ Fiji | Acquiring and processing z-stack images |
References
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