Oppdagelse av metastatiske regulatorer ved hjelp av en rask og kvantitativ intravital chick chorioallantoic membranmodell

Summary

Dette er en effektiv metode for å screene for undertrykkere eller drivere av kreftmetastase. Celler, transdusert med et uttrykksbibliotek, injiseres i kylling chorioallantoic membrane vaskulaturen for å danne metastatiske kolonier. Kolonier som har redusert eller økt invasivitet, blir utskilt, utvidet, reinjisert for å bekrefte fenotypen, og til slutt analysert ved hjelp av høy gjennomstrømningssekvensering.

Abstract

Nylige fremskritt innen kreftforskning har illustrert den svært komplekse karakteren av kreftmetastase. Flere gener eller gennettverk har vist seg å være involvert i differensialregulering av kreftmetastatiske kaskadegener og genprodukter avhengig av krefttype, vev og individuelle pasientkarakteristikker. Disse representerer potensielt viktige mål for genetiske terapeutiske og personlige medisintilnærminger. Utviklingen av raske screeningplattformer er avgjørende for identifisering av disse genetiske målene.

Kylling chorioallantoic membranen (CAM) er en svært vaskulær, kollagenrik membran som ligger under eggeskallet som muliggjør gassutveksling i det utviklende embryoet. På grunn av plasseringen og vaskulariseringen av CAM utviklet vi den som en intravital human kreftmetastasemodell som muliggjør robust human kreftcelle xenografting og sanntidsavbildning av kreftcelleinteraksjoner med kollagenrik matrise og vaskulatur.

Ved hjelp av denne modellen ble en kvantitativ screeningplattform designet for identifisering av nye drivere eller undertrykkere av kreftmetastase. Vi transduserte et basseng med hode- og nakke HEp3 kreftceller med et komplett humant genom shRNA genbibliotek, og injiserte deretter cellene, ved lav tetthet, i CAM-vaskulaturen. Cellene spredte seg og dannet ensvulstcellekolonier. Individuelle kolonier som ikke var i stand til å invadere inn i CAM-vevet var synlige som en kompakt kolonifenotype og utskilt for identifisering av den transinduserte shRNA som finnes i cellene. Bilder av individuelle kolonier ble evaluert for deres invasivitet. Flere runder med valg ble utført for å redusere frekvensen av falske positiver. Individuelle, isolerte kreftcellekloner eller nyutviklede kloner som uttrykker gener av interesse, ble utsatt for primær tumordannelsesanalyse eller kreftcellevaskulatur-samarbeidsanalyse. Oppsummert presenterer vi en rask screeningplattform som muliggjør antimetastatisk målidentifikasjon og intravital analyse av en dynamisk og kompleks kaskade av hendelser.

Introduction

Metastase er hovedårsaken til kreftpasientdød^1,2,3. Metastatiske kreftceller bruker distinkte signalveier, avhengig av type kreft, gjennom de fem trinnene i den metastatiske kaskaden: lokal invasjon, intravasasjon, overlevelse i sirkulasjonen, ekstravasasjon og koloniutvidelse på fjerne metastatiske steder. Nåværende forståelse av denne metastatiske prosessen antyder at det er to flaskehalstrinn, en er retningsinvasjon av kreftcellen fra den primære svulsten, og den andre er etableringen av det fjerne stedet metastatisk lesjon^4,5,6. Begge trinnene krever at kreftceller aktivt samhandler med kollagen og vaskulatur på steder for første invasjon eller fjern metastatisk lesjonsdannelse. Derfor må metastatiske kreftceller kunne feste seg til celler, ombygge kollagenfibre og retningsinntrenge langs vaskulære vegger⁷. Screeningmodeller som raskt kan identifisere antimetastatiske terapeutiske mål for å blokkere kreftceller fra å fullføre disse trinnene, er av høyeste betydning. Eksisterende in vitro screening modeller etterligner ikke fullt ut det komplekse levende vevsmiljøet. Musemodeller er kostbare og tidkrevende. Derfor er det et presserende behov for intravitale screeningplattformer som gir komplekse levende vevsmiljøer og rask identifisering av mål.

I løpet av det siste tiåret har kyllingembryoet blitt etablert som en robust og kostnadseffektiv modell for human kreftmetastase^8,9,10,11,12. Kylling chorioallantoic membrane (CAM) vevet er tynt og gjennomskinnelig som gjør det ideelt for intravital mikroskopisk avbildning av celle- og koloniatferd i primærsvulst og / eller metastatiske steder¹². Primær tumorvekst fra flere cellelinjer for human kreft kan initieres og metastaseres i løpet av bare flere dager etter mikroinjeksjon i CAM-vevet. Kreftceller kan administreres i CAM-vevet på flere måter, inkludert intravenøst, intra-CAM eller som kollagen onplanter, denne fleksibiliteten gjør det mulig for forskeren å fokusere på spesifikke stadier av kreftprogresjon, for eksempel metastatisk lesjonsdannelse, invasjon ut av den primære svulsten eller angiogenesen.

Her beskriver vi en kvantitativ screeningplattform som kan brukes til å måle kreftcellens evne til å etablere invasive metastatiske lesjoner. Kreftceller som har blitt transdusert med et uttrykksbibliotek injiseres intravenøst i CAM-vaskulaturen ved lav tetthet. Metastatiske kolonier dannes i 4-5 dager, deretter evalueres invasjonskapasiteten og vaskulaturinteraksjonen av de resulterende koloniene. Individuelle kolonier som ikke invaderer blir utskilt, forplantet og deres fenotype bekreftes i CAM ved reinjeksjon og kvantifisering av kolonikomprimering og kreftcelleblodkarkontakter. Uttrykksbiblioteket som er ansvarlig for den enkle metastatiske kolonimutantfenotypen, identifiseres fra isolert kolonigenomisk DNA via sekvensering med høy gjennomstrømning. Den samme plattformen kan videre brukes til å validere årsakssammenhengen mellom et gen og den observerte fenotypen eller til å utføre dyptgående mekanistiske studier på den observerte fenotypen.

Protocol

Alle eksperimenter ble utført i samsvar med regelverket og retningslinjene til Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Alberta. Fugleembryoer anses ikke å være levende dyr av mange forskningsinstitutter, og det kreves ingen dyreprotokoller. Det er imidlertid et akseptert syn at fugleembryoer kan føle smerte og derfor må behandles så humant som mulig. Den lokale dyreforskningsmyndigheten må kontaktes før forskningsarbeid påbegynnes for å sikre at forsvarlig regelverk følges. <p class="…

Representative Results

Kreftcelleinjeksjon anses å være vellykket hvis flertallet av cellene som ligger i kapillærene er enkle og ligger med en betydelig forskjell fra hverandre (~ 0,05-0,1 cm) slik at koloniene ikke overlapper etter 5-6 dager inkubasjonsperiode (figur 3A). Injeksjonen var ikke vellykket hvis en opphopning av kreftceller kan ses i de fleste kapillærer, embryoer som viser dette bør kastes (Figur 2E). Et betydelig antall injiserte k…

Discussion

Her beskriver vi en rask fluorescensmikroskopibasert intravital screeningprotokoll som kan brukes til viktige bruksområder som genetiske eller narkotikakandidatskjermer. Kreftceller som har blitt transdusert med et genetisk bibliotek av interesse eller transfektert med individuelle uttrykkskonstruksjoner, kan raskt screenes og kvantifiseres med hensyn til fenotype av interesse ved hjelp av denne chick CAM-modellen. Siden transduksjons- eller transfeksjonsprotokoller varierer betydelig, avhengig av bibliotekstypen, er de…

Materials

1 mL disposable syringes	BD	BD309659
15 mL conical centrifuge tubes.	Corning	CLS430791-500EA
18 gauge x 1 1/2  BD precision needle	BD	BD305196	we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred
2.5% Trypsin solution	many sources are available
4T1 mouse breast cancer	ATCC	CRL-2539
B16F10 mouse melanoma cell line	ATCC	CRL-6475
Benchtop centrifuge.	many sources are available		Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable
Circular coverslips, 22 mm.	Fisher Scientific	12-545-101
Collagenase	Sigma	C0130-100MG
Confocal microscope			We use Nikon A1r
cotton swabs	many sources are available		must be sterilized before use
Culture media appropriate for the cell lines used	many sources are available		We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media
Egg incubator	many sources are available		An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or  Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA
eppendor tubes , 1.5ml	Sigma	T4816-250EA
Fertilized White Leghorn eggs	any local supplyer
fine forceps	many sources are available		must be sterilized begfore use
Hemocytometer	Millipore-Sigma	MDH-4N1-50PK
HT1080 human fibrosarcoma cell line	ATCC	CCL-121
Image analysis software			We use Nikon Elements
Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine	Vector Laboratories	RL-1042, FL-1041	Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening
MDA-MB-468 human breast cancer	ATCC	HTB-132
PBS (1x)	many sources are available
Plastic weighting dishes	Simport	CA11006-614	dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available
small surgical scissors	many sources are available		must be sterilized before use
Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length	Sutter Instrument	BF100-58-10
Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes).	VWR	CA25378-115	dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available
Stereo fluorescent microscope			We use Zeiss Lumar v12
Tygon R-3603 laboratory tubing	Cole-Parmer	AAC00001	1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness
U-118 MG human glioblastoma	ATCC	HTB-15
U-87 MG human glioblastoma	ATCC	HTB-14
Vertical pipette puller	many sources are available		we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720