Summary

Imaging di proteine podocitiche Nefrrina, Actina e Podocina con microscopia di espansione

Published: April 23, 2021
doi:

Summary

Il metodo presentato consente la visualizzazione di proteine cellulari etichettate fluorescentmente con microscopia di espansione che porta a una risoluzione di 70 nm su un microscopio convenzionale.

Abstract

L’interruzione del filtro glomerulare composto dall’endotelio glomerulare, dalla membrana basale glomerulare e dai podociti, si traduce in albuminuria. I processi del piede dei podociti contengono fasci di actina che si legano alle proteine dell’adattatore citoscheletricho come la podocina. Queste proteine dell’adattatore, come la podocina, collegano la spina dorsale del diaframma a fessura glomerulare, come la nefrina, all’actina citoscheletro. Studiare la localizzazione e la funzione di queste e di altre proteine podocitiche è essenziale per la comprensione del ruolo del filtro glomerulare nella salute e nelle malattie. Il protocollo presentato consente all’utente di visualizzare actina, podocina e nefrrina nelle cellule con imaging a super risoluzione su un microscopio convenzionale. In primo luogo, le cellule sono macchiate con una tecnica di immunofluorescenza convenzionale. Tutte le proteine all’interno del campione vengono quindi covalentemente ancorate a un idrogel gonfiabile. Attraverso la digestione con proteinasi K, le proteine strutturali vengono scissa permettendo gonfiore isotropico del gel nell’ultimo passaggio. La dialisi del campione in acqua si traduce in un’espansione di 4-4,5 volte del campione e il campione può essere immaginato tramite un microscopio a fluorescenza convenzionale, rendendo una risoluzione potenziale di 70 nm.

Introduction

L’albuminuria è un parametro surrogato del rischio cardiovascolare e deriva dall’interruzione del filtro glomerulare1. Il filtro glomerulare è composto dall’endotelio fenestrato, dalla membrana basale glomerulare e dal diaframma a fessura formato dai podociti. I processi del piede primario e secondario dei podociti avvolgono la parete capillare del glomerulum2. La delicata struttura dei processi del piede è mantenuta da fasci di actina corticale che fungono anche da ancore per proteine del diaframma a fessura multipla e altre proteine dell’adattatore2. La proteina dorsale del diaframma fessurato è chiamata nefrina e interagisce in modo omofilo con molecole di nefrrina di podociti opposti. Attraverso diverse proteine dell’adattatore, la nefrrina è legata all’actina citoscheletro2,3. Mutazioni nel gene nphrin-codificante NPHS1 portano alla sindrome nefrotica del finlandese di tipo4.

Una delle proteine interagenti della nefrina è la podocina, una proteina simile a una forcina della famiglia delle stomatine3. La podocina recluta nefrrina alle zattere lipidiche e la collega all’actina citoscheletro5. La podocina è codificata dal gene NPHS2. Mutazioni in NPHS2 portano alla sindrome nefrotica resistente agli steroidi6.

Per visualizzare e co-localizzare le proteine dell’adattatore di actina, possono essere utilizzate tecniche di immunofluorescenza. Sfortunatamente, la barriera di diffrazione della luce limita la risoluzione dei microscopi a fluorescenza convenzionali a 200-350 nm7. Le nuove tecniche di microscopia, ad esempio l’esaurimento delle emissioni stimolate (STED)8,la microscopia di localizzazione fotoattivata (PALM)9,la microscopia per la ricostruzione ottica stocastica (STORM o dSTORM) o la microscopia a cancellazione dello stato del suolo seguita dal ritorno della singola molecola (GSDIM)9,10,11, consentono una risoluzione fino a circa 10 nm. Tuttavia, queste tecniche di super risoluzione richiedono microscopi molto costosi, personale ben addestrato e quindi non sono disponibili in molti laboratori.

La microscopia di espansione (ExM) è una tecnica nuova e semplice che consente l’imaging a super risoluzione con microscopi convenzionali ed è potenzialmente disponibile per una grande comunità di ricerca12. Nella microscopia di espansione della ritenzione proteica (proExM), il campione di interesse (cellule o tessuti) è fisso e macchiato di fluorofori13. Le proteine all’interno del campione vengono quindi covalentemente ancorate da una piccola molecola (acido 6-((Acriloil)ammino)esanoico, estere succinimidile, AcX) in un idrogel gonfiabile13. Attraverso la digestione enzimatica con proteinasi K (ProK), proteine e fluorofori mantengono la loro posizione relativa all’interno del gel dopol’espansione 13. Dopo il gonfiore del gel, il campione si espande fino a 4,5 volte (espansione volumetrica di 90 volte) portando ad un’efficace risoluzione laterale di circa 60-70 nm (300 nm/4.5). Le modifiche di questa tecnica possono anche consentire un’espansione di 10 volte (espansione volumetrica di 1.000 volte), rendendo una risoluzione di 20-30 nm sui microscopiconvenzionali 14,15,16.

Le strutture glomerulari del topo e dei reni umani sono state visualizzate tramite ExM17. All’interno di questo documento, presentiamo un protocollo proExM dettagliato per visualizzare immagini a super risoluzione di F-actin e la podocina proteica dell’adattatore actina all’interno delle cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza convenzionale.

Protocol

1. Scissione e semina di cellule Riscaldare il mezzo dell’aquila modificata (DMEM) sterile di Dulbecco, incluso il siero di vitello fetale al 10% (FCS), la salina tamponata di fosfato sterile (PBS) e la tripside sterile a 37 °C. Attivare la panca pulita. Preparare una piastra da 6 pomp po’ aggiungendo un foglietto di copertura sterile in vetro (10 mm) a ciascun pozzo utilizzando forcep sterili. Metti un piatto di coltura cellulare di 10 cm con celle Cos7 sotto la panca pulita. Sotto il ban…

Representative Results

Il concetto e la tempistica di questo protocollo proExM sono illustrati nella figura 1. Il giorno 5, le cellule trasfette sono fisse e macchiate con anticorpi fluorescenti mirati alla proteina di interesse(Figura 1A,B). Il giorno 6, il trattamento con AcX porta alla formazione di gruppi amminici su tutte le proteine (compresi i fluorofori)(Figura 1A,B)<sup class="xre…

Discussion

Il metodo presentato consente allo sperimentatore di visualizzare proteine cellulari, ad esempio podocina, nefrrina e componenti citoscheletrici, ad esempio F-actina. All’interno di questo protocollo, le cellule cos7 trasfette sono usate come modello per studiare l’interazione delle proteine del diaframma a fessura con f-actina. Sfortunatamente, le linee cellulari dei podociti immortalate non esprimono quantità endogene sufficienti di proteine del diaframma fessurato19.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano Blanka Duvnjak e Nikola Kuhr per l’eccellente assistenza tecnica.

Materials

Acrylamide >99% Sigma-Aldrich A3553-100G
6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE invitrogen A-20770 store up to 4 months
APS Sigma-Aldrich A3678-25G
Deckgläser (cover glasses) Engelbrecht K12432 24x32mm #1.0
Diamont cutter VWR 201-0392 for cutting the cover slips
Guanidine HCl Sigma-Aldrich G3272-100G 8M Stock can be kept at RT
Marten hair paintbrush Leon Hardy 3 (770)
"Menzel" Deckgläser (cover glasses) Thermo Fischer  15654786 24x24mm #1.5
N,N`-Methylenbisacrylamide Sigma-Aldrich M7256-25G
Objektträger UniMark Marienfeld 703010
Proteinase K New England Biolabs P8107S
Sodium Acrylate Sigma-Aldrich 408220 check purity 
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Staining chamber produced at the university's workshop
TEMED ROTH 2367.1
6-Well glass bottom plates Cellvis P06-1.5H-N
Antibodies
Actin-ExM 546  chrometra non-available 1:40
Anti Podocin produced in rabbit Sigma P-0372-200UL 1:200
Donkey anti guinea-pig CF633 Sigma SAB4600129-50UL 1:200
Goat anti rabbit 488 Life Technologies A11034 1:1000
Guinea pig anti nephrin Origene BP5030 1:100
Software
FIJI
Visiview
microscope
AXIO Observer Z1 Zeiss non-available

References

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Cite This Article
Königshausen, E., Schmitz, C. T., Rump, L. C., Sellin, L. Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy. J. Vis. Exp. (170), e62079, doi:10.3791/62079 (2021).

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