تحليل الترجمة في الدماغ الماوس النامية باستخدام التنميط متعددة
Summary
يتطلب تطور دماغ الثدييات التحكم السليم في التعبير الجيني على مستوى الترجمة. هنا، ونحن نصف نظام التنميط متعددة مع سهلة لتجميع السكروز التدرج صنع ومنصة الكسر لتقييم الحالة التحويلية من الحمض النووي الريبي في الدماغ النامية.
Abstract
يعتمد التطور السليم لدماغ الثدييات على توازن دقيق بين انتشار الخلايا الجذعية العصبية والتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا العصبية. يتم التحكم في هذا التوازن بإحكام من خلال التعبير الجيني الذي يتم ضبطه على مستويات متعددة ، بما في ذلك النسخ وما بعد النسخ والترجمة. وفي هذا الصدد، تبرز مجموعة متزايدة من الأدلة دورا حاسما للتنظيم التحويلي في تنسيق قرارات مصير الخلايا الجذعية العصبية. الكسر المتعدد هو أداة قوية لتقييم حالة الحمض النووي الريبي الترجمي على المستويين الجيني العالمي والفردي. هنا، نقدم خط أنابيب متعدد السمات في المنزل لتقييم الكفاءة التحويلية في الخلايا من قشرة الدماغ الماوس النامية. نحن نصف بروتوكولات إعداد تدرج السكروز وتحلل الأنسجة والطرد الفائق والتحليل القائم على الكسر للحالة الترجمية ل mRNA.
Introduction
أثناء تطور دماغ الثدييات ، تتكاثر الخلايا الجذعية العصبية وتفرق لتوليد الخلايا العصبية وجليا1،2 . اضطراب هذه العملية يمكن أن يؤدي إلى تغييرات في بنية الدماغ ووظيفة, كما رأينا في العديد من اضطرابات النمو العصبي3,4. السلوك السليم للخلايا الجذعية العصبية يتطلب التعبير المنظم لجينات محددة5. في حين تمت دراسة التحكم اللاجيني والنسخي لهذه الجينات بشكل مكثف ، تشير النتائج الأخيرة إلى أن تنظيم الجينات على مستويات أخرى يساهم أيضا في تنسيق انتشار الخلايا الجذعية العصبية والتمايز6و7و8و9و10. وبالتالي ، فإن معالجة برامج التحكم التحويلية سوف تعزز بشكل كبير فهمنا للآليات الكامنة وراء قرار مصير الخلايا الجذعية العصبية وتطور الدماغ.
وقد طبقت ثلاث تقنيات رئيسية مع نقاط قوة مختلفة على نطاق واسع لتقييم الوضع الترجمي من مرنا، بما في ذلك التنميط ريبوسوم، وترجمة تنقية تقارب الريبوسوم (TRAP) والتنميط متعدد السمات. التنميط ريبوسوم يستخدم تسلسل الحمض النووي الريبي لتحديد شظايا الحمض النووي الريبي المحمية ريبوسوم، مما يسمح للتحليل العالمي لعدد وموقع ترجمة الريبوسومات على كل نسخة لاستنتاج غير مباشر معدل الترجمة من خلال مقارنتها وفرة النص11. TRAP يستفيد من البروتينات الريبوسومية الموسومة بالظهارة لالتقاط الريبوسوم ملزمة mRNAs12. وبالنظر إلى أنه يمكن التعبير عن البروتينات الريبوسومية الموسومة في أنواع خلايا محددة باستخدام النهج الوراثية، يسمح TRAP بتحليل الترجمة بطريقة خاصة بنوع الخلية. وبالمقارنة، فإن التنميط المتعدد، الذي يستخدم تجزئة تدرج كثافة السكروز لفصل الجزء الحر والسيء الترجمة (أحاديات أخف وزنا) عن تلك التي تترجم بنشاط عن طريق الريبوسومات (البوليسومات الأثقل)، يوفر قياسا مباشرا لكثافة الريبوسوم على مرنا13. ميزة واحدة تقدم هذه التقنية هو براعة لدراسة ترجمة مرنا محددة من الفائدة، فضلا عن تحليل ترجمة الجينوم على نطاقواسع 14.
في هذه الورقة، ونحن نصف بروتوكول مفصل من التنميط متعددة لتحليل قشرة الدماغ الماوس النامية. نحن نستخدم نظام تجميعها في المنزل لإعداد تدرجات كثافة السكروز وجمع الكسور لتطبيقات المصب. يمكن تكييف البروتوكول المعروض هنا بسهولة لتحليل أنواع أخرى من الأنسجة والكائنات الحية.
Protocol
Representative Results
Discussion
التنميط المتعدد هو تقنية شائعة الاستخدام وقوية لتقييم الحالة الترجمية في كل من الجينات الفردية ومستويات الجينوم على نطاق14. في هذا التقرير، نقدم بروتوكولا للتنميط المتعدد باستخدام منصة تجميعها في المنزل وتطبيقها لتحليل قشرة الماوس النامية. هذه المنصة الفعالة من حيث التكلفة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من منحة اكتشاف NSERC (RGPIN/04246-2018 إلى G.Y.). G.Y. هو كرسي البحوث الكندية. تم تمويل S.K. من قبل زمالة Mitacs Globalink للدراسات العليا ومنحة طلاب الدراسات العليا في ACHRI.
Materials
| 1.5 mL RNA free microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm dish | Greiner-Bio | 664160 | |
| 1M MgCl2 | Invitrogen | AM9530G | |
| 21-23G needle | BD | 305193 | |
| 2M KCl | Invitrogen | AM8640G | |
| 30 mL syringe | BD | 302832 | |
| Blunt end needle | VWR | 20068-781 | |
| Breadboard | Thorlabs | MB2530/M | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| CD1 mouse | Charles River Laboratory | ||
| Curved tip forceps | Sigma | #Z168785 | |
| Cycloheximide | Sigma | 66-81-9 | |
| Data acquisition software TracerDAQ | Measurement Computing | ||
| Digital converter | Measurement Computing | USB-1208LS | |
| Direct-zol RNA miniprep kit | Zymo | R2070 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-basic | 12-03-3483 | |
| DMSO | Bioshop | 67-68-5 | |
| Dumont No.5 forceps | Sigma | #F6521 | |
| Fraction collector | Bio-Rad | Model 2110 | |
| HBSS | Wisent | 311-513-CL | |
| Linear stage actuator | Rattmmotor | CBX1605-100A | |
| Luciferase control RNA | Promega | L4561 | |
| Maxima first strand cDNA synthesis kit | Themo Fisher | M1681 | |
| Miniature V-clamp | Thorlabs | VH1/M | |
| Mini-series breadboard | Thorlabs | MSB7515/M | |
| Mini-series optical post | Thorlabs | MS2R/M | |
| Mini-series pedestal post holder base | Thorlabs | MBA1 | |
| NaCl | Bio-basic | 7647-14-5 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| Ø12.7 mm aluminum post | Thorlabs | TRA150/M | |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| PerfeCTa SYBR green fastmix | Quanta Bio | CA101414-274 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Puromycin | Bioshop | 58-58-2 | |
| Right-angle clamp | Thorlabs | RA90/M | |
| Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp | Thorlabs | RA90TR/M | |
| Rnase AWAY | Molecular BioProducts | 7002 | |
| RNase free tips | Frogga Bio | FT10, FT200, FT1000 | |
| RNase free water | Wisent | 809-115-CL | |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| Slim right-angle bracket | Thorlabs | AB90B/M | |
| Small V-clamp | Thorlabs | VC1/M | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 302-95-4 | |
| Stepper motor driver | SongHe | TB6600 | |
| Sucrose | Bioshop | 57501 | |
| SW 41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Triton-X-100 | Bio-basic | 9002-93-1 | |
| Trizol | Thermofisher Scientific | 15596018 | |
| Tube piercer | Brandel | BR-184 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L8-70M | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| UNO project super starter kit | Elegoo | EL-KIT-003 | |
| UV monitor | Bio-Rad | EM-1 Econo | |
| Vertical bracket | Thorlabs | VB01A/M |
References
- Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).
- Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).
- Fiddes, I. T., et al. Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis. Cell. 173, 1356-1369 (2018).
- Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106, 404-420 (2020).
- Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).
- Amadei, G., et al. A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis. Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).
- Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program. Neuron. 84, 723-739 (2014).
- Yang, G., et al. A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring. Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).
- Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).
- Rodrigues, D. C., et al. Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells. Nature Communications. 11, 2018 (2020).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
- Chekulaeva, M., Landthaler, M. Eyes on translation. Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling. Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).
- Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).
- Kraushar, M. L., et al. Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes. Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).
