使用多体分析在发育中的鼠标大脑中进行翻译分析
Summary
哺乳动物大脑的发展需要在翻译水平上正确控制基因表达。在这里，我们描述了一个多体分析系统，该系统具有易于组装的蔗糖梯度制作和分馏平台，以评估 mRNA 在发育中的大脑中的转化状态。
Abstract
哺乳动物大脑的正常发育依赖于神经干细胞增殖和分化成不同神经细胞类型的精细平衡。这种平衡由基因表达紧密控制，基因表达在多个级别进行微调，包括转录、转录后和翻译。在这方面，越来越多的证据突出了转化调节在协调神经干细胞命运决定方面的关键作用。多体分馏是评估全球和单个基因水平的 mRNA 转化状态的有力工具。在这里，我们提出了一个内部聚体分析管道，以评估细胞的转化效率从正在发育的老鼠大脑皮层。我们描述了蔗糖梯度制备、组织裂解、超中心化和基于分数的 mRNA 转化状态分析的协议。
Introduction
在哺乳动物大脑发育过程中，神经干细胞增殖和分化产生神经元和胶质1，2。这个过程的扰动会导致大脑结构和功能的改变，如许多神经发育障碍3，4。神经干细胞的正确行为需要特定基因5的精心表达。虽然对这些基因的表观遗传学和转录控制进行了深入的研究，但最近的发现表明，其他层面的基因调控也有助于协调神经干细胞增殖和分化6、7、8、9、10。因此，解决转化控制程序将极大地促进我们对神经干细胞命运决定和大脑发育背后的机制的理解。
三种具有不同优势的主要技术已被广泛应用于评估 mRNA 的转化状态，包括核糖体分析、翻译核糖体亲和力纯化 （TRAP） 和多体分析。Ribosome 分析使用 RNA 测序来确定受核糖体保护的 mRNA 片段，从而允许对每个成绩单上转译核糖体的数量和位置进行全球分析，通过将其与成绩单丰度11进行比较间接推断翻译率。TRAP利用表位标记的核糖体蛋白来捕获与核糖体结合的mRNA12。鉴于标记的核糖核蛋白可以使用遗传方法在特定的细胞类型中表达，TRAP 允许以特定于细胞类型的方式分析翻译。相比之下，多体分析，它使用蔗糖密度梯度分馏分离自由和翻译不良的部分（较轻的单体）与那些被积极翻译的核糖体（较重的多体），提供了直接测量核糖体密度在mRNA13。这项技术提供的一个优点是其多功能性，以研究翻译特定的mRNA的兴趣，以及全基因组的转学分析14。
本文描述了一个详细的多体特征分析方案，以分析正在发育的老鼠大脑皮层。我们使用家庭组装系统来准备蔗糖密度梯度，并为下游应用收集分数。这里提出的协议可以很容易地适应分析其他类型的组织和生物体。
Protocol
所有动物的使用都由卡尔加里大学动物护理委员会监督。用于实验的CD1小鼠是从商业供应商那里购买的。 1. 准备解决方案 注意防止RNA降解，喷洒工作台和所有设备与RNASE净化溶液。实验中使用无鼻塞提示。所有解决方案均在无 RNase 水中准备。 在 DMSO 中准备环氧化物库存解决方案 （100 毫克/mL），并存储在 -20 °C。 通过在无 RNase 水中加入 75…
Representative Results
作为证明，含有75μgRNA（从8个胚胎中汇集）的皮质分析被蔗糖梯度分成12个分数。紫外线吸收峰值在254纳米识别分数包含40S亚单位，60S亚单位，80S单体和多体（图4A）。Rpl10通过对大型核糖体亚单位的西色斑点进行分析，显示其存在60S子单元（分数3）、单体（分数4）和多体（分数5-12）（图4B）。相比之下，细胞质蛋白Gapdh和Csde1与核糖体无关，而是富含?…
Discussion
多体特征分析是一种常用和强大的技术，用于评估单个基因和全基因组14 级的转化状态。在本报告中，我们提出了一个多体分析协议，使用家庭组装的平台及其应用来分析正在发育的鼠标皮层。这个经济高效的平台易于组装和生成坚固、可重复的蔗糖梯度和具有高灵敏度的多体剖析。
值得注意的是，制备一致和优质蔗糖梯度对于获得可重复的多体剖析结果<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作由国家SERC发现基金（RGPIN/04246-2018至纽约）资助。G.Y.是加拿大研究主席。S.K. 由米塔克斯全球研究生奖学金和 ACHRI 研究生奖学金资助。
Materials
| 1.5 mL RNA free microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm dish | Greiner-Bio | 664160 | |
| 1M MgCl2 | Invitrogen | AM9530G | |
| 21-23G needle | BD | 305193 | |
| 2M KCl | Invitrogen | AM8640G | |
| 30 mL syringe | BD | 302832 | |
| Blunt end needle | VWR | 20068-781 | |
| Breadboard | Thorlabs | MB2530/M | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| CD1 mouse | Charles River Laboratory | ||
| Curved tip forceps | Sigma | #Z168785 | |
| Cycloheximide | Sigma | 66-81-9 | |
| Data acquisition software TracerDAQ | Measurement Computing | ||
| Digital converter | Measurement Computing | USB-1208LS | |
| Direct-zol RNA miniprep kit | Zymo | R2070 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-basic | 12-03-3483 | |
| DMSO | Bioshop | 67-68-5 | |
| Dumont No.5 forceps | Sigma | #F6521 | |
| Fraction collector | Bio-Rad | Model 2110 | |
| HBSS | Wisent | 311-513-CL | |
| Linear stage actuator | Rattmmotor | CBX1605-100A | |
| Luciferase control RNA | Promega | L4561 | |
| Maxima first strand cDNA synthesis kit | Themo Fisher | M1681 | |
| Miniature V-clamp | Thorlabs | VH1/M | |
| Mini-series breadboard | Thorlabs | MSB7515/M | |
| Mini-series optical post | Thorlabs | MS2R/M | |
| Mini-series pedestal post holder base | Thorlabs | MBA1 | |
| NaCl | Bio-basic | 7647-14-5 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| Ø12.7 mm aluminum post | Thorlabs | TRA150/M | |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| PerfeCTa SYBR green fastmix | Quanta Bio | CA101414-274 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Puromycin | Bioshop | 58-58-2 | |
| Right-angle clamp | Thorlabs | RA90/M | |
| Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp | Thorlabs | RA90TR/M | |
| Rnase AWAY | Molecular BioProducts | 7002 | |
| RNase free tips | Frogga Bio | FT10, FT200, FT1000 | |
| RNase free water | Wisent | 809-115-CL | |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| Slim right-angle bracket | Thorlabs | AB90B/M | |
| Small V-clamp | Thorlabs | VC1/M | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 302-95-4 | |
| Stepper motor driver | SongHe | TB6600 | |
| Sucrose | Bioshop | 57501 | |
| SW 41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Triton-X-100 | Bio-basic | 9002-93-1 | |
| Trizol | Thermofisher Scientific | 15596018 | |
| Tube piercer | Brandel | BR-184 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L8-70M | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| UNO project super starter kit | Elegoo | EL-KIT-003 | |
| UV monitor | Bio-Rad | EM-1 Econo | |
| Vertical bracket | Thorlabs | VB01A/M |
References
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Cite This Article
Kedia, S., Erickson, S. L., Yang, G. Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling. J. Vis. Exp. (171), e62088, doi:10.3791/62088 (2021).