Analyse af oversættelse i den udviklende musehjerne ved hjælp af polysom profilering
Summary
Udviklingen af pattedyrshjernen kræver ordentlig kontrol af genekspression på oversættelsesniveau. Her beskriver vi et polysome profileringssystem med en platform, der er nem at samle saccharosegradientfremstilling og fraktioneringsplatform for at vurdere mRNA’ernes translationelle status i den udviklende hjerne.
Abstract
Den korrekte udvikling af pattedyrshjernen er afhængig af en fin balance mellem spredning af neurale stamceller og differentiering i forskellige neurale celletyper. Denne balance styres tæt af genekspression, der finjusteres på flere niveauer, herunder transskribering, posttransskription og oversættelse. I denne henseende fremhæver en voksende mængde beviser en kritisk rolle translationel regulering i koordineringen af neurale stamcelle skæbne beslutninger. Polysomefraktion er et effektivt værktøj til vurdering af mRNA-oversættelsesstatus på både globalt og individuelt genniveau. Her præsenterer vi en intern polysome profileringspipeline for at vurdere translationel effektivitet i celler fra den udviklende muse cerebral cortex. Vi beskriver protokollerne for saccharosegradientpræparat, væv lysis, ultracentrifugering og fraktioneringsbaseret analyse af mRNA-oversættelsesstatus.
Introduction
Under udviklingen af pattedyrshjernen formerer neurale stamceller sig og differentierer sig for at generere neuroner og glia1,2 . Forstyrrelsen af denne proces kan føre til ændringer i hjernens struktur og funktion, som det ses i mange neuroudviklingsforstyrrelser3,4. Den korrekte opførsel af neurale stamceller kræver orkestreret udtryk for specifikke gener5. Mens den epigenetiske og transskriptionelle kontrol af disse gener er blevet intensivt undersøgt, tyder nylige resultater på, at genregulering på andre niveauer også bidrager til koordinering af neural stamcellespredning og differentiering6,7,8,9,10. Således vil løse translationelle kontrolprogrammer i høj grad fremme vores forståelse af de mekanismer, der ligger til grund neurale stamcelle skæbne beslutning og hjernens udvikling.
Tre hovedteknikker med forskellige styrker er blevet anvendt bredt til at vurdere mRNA’s translationelle status, herunder ribosome profilering, oversættelse af ribosome affinitetsrensning (TRAP) og polysome profilering. Ribosome-profilering bruger RNA-sekventering til at bestemme ribosome-beskyttede mRNA-fragmenter, hvilket gør det muligt for den globale analyse af antallet og placeringen af oversættelse af ribosomer på hver udskrift indirekte at udlede oversættelseshastigheden ved at sammenligne den med udskriftstæthed11. TRAP udnytter epitop-mærkede ribosomale proteiner til at fange ribosome-bundetmRNA’er 12. I betragtning af at de mærkede ribosomale proteiner kan udtrykkes i specifikke celletyper ved hjælp af genetiske tilgange, tillader TRAP analyse af oversættelse på en celletypespecifik måde. Til sammenligning giver polysome profilering, der bruger gradientfraktionering af saccharosetæthed til at adskille fri og dårligt oversat portion (lettere monosomer) fra dem, der aktivt oversættes af ribosomer (tungere polysomer), en direkte måling af ribosomtæthed på mRNA13. En fordel denne teknik tilbyder, er dens alsidighed til at studere oversættelsen af specifikke mRNA af interesse samt genom-dækkende translatome analyse14.
I dette papir beskriver vi en detaljeret protokol med polysome profilering for at analysere den udviklende muse cerebral cortex. Vi bruger et hjemmemonteret system til at forberede saccharosetæthedsgradienter og indsamle fraktioner til downstream-applikationer. Den protokol, der præsenteres her, kan let tilpasses til at analysere andre typer væv og organismer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Polysome profilering er en almindeligt anvendt og kraftfuld teknik til at vurdere oversættelsesstatus på både enkelt gen og genom-dækkende niveauer14 . I denne rapport præsenterer vi en protokol med polysome profilering ved hjælp af en hjemmemonteret platform og dens anvendelse til at analysere den udviklende musebark. Denne omkostningseffektive platform er nem at samle og generere robuste, reproducerbare saccharosegradienter og polysomprofilering med høj følsomhed.
<p class="jove_cont…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af en NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 til G.Y.). G.Y. er en Canada Research Chair. S.K. blev finansieret af Mitacs Globalink Graduate Fellowship og ACHRI Graduate Student Scholarship.
Materials
| 1.5 mL RNA free microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm dish | Greiner-Bio | 664160 | |
| 1M MgCl2 | Invitrogen | AM9530G | |
| 21-23G needle | BD | 305193 | |
| 2M KCl | Invitrogen | AM8640G | |
| 30 mL syringe | BD | 302832 | |
| Blunt end needle | VWR | 20068-781 | |
| Breadboard | Thorlabs | MB2530/M | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| CD1 mouse | Charles River Laboratory | ||
| Curved tip forceps | Sigma | #Z168785 | |
| Cycloheximide | Sigma | 66-81-9 | |
| Data acquisition software TracerDAQ | Measurement Computing | ||
| Digital converter | Measurement Computing | USB-1208LS | |
| Direct-zol RNA miniprep kit | Zymo | R2070 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-basic | 12-03-3483 | |
| DMSO | Bioshop | 67-68-5 | |
| Dumont No.5 forceps | Sigma | #F6521 | |
| Fraction collector | Bio-Rad | Model 2110 | |
| HBSS | Wisent | 311-513-CL | |
| Linear stage actuator | Rattmmotor | CBX1605-100A | |
| Luciferase control RNA | Promega | L4561 | |
| Maxima first strand cDNA synthesis kit | Themo Fisher | M1681 | |
| Miniature V-clamp | Thorlabs | VH1/M | |
| Mini-series breadboard | Thorlabs | MSB7515/M | |
| Mini-series optical post | Thorlabs | MS2R/M | |
| Mini-series pedestal post holder base | Thorlabs | MBA1 | |
| NaCl | Bio-basic | 7647-14-5 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| Ø12.7 mm aluminum post | Thorlabs | TRA150/M | |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| PerfeCTa SYBR green fastmix | Quanta Bio | CA101414-274 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Puromycin | Bioshop | 58-58-2 | |
| Right-angle clamp | Thorlabs | RA90/M | |
| Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp | Thorlabs | RA90TR/M | |
| Rnase AWAY | Molecular BioProducts | 7002 | |
| RNase free tips | Frogga Bio | FT10, FT200, FT1000 | |
| RNase free water | Wisent | 809-115-CL | |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| Slim right-angle bracket | Thorlabs | AB90B/M | |
| Small V-clamp | Thorlabs | VC1/M | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 302-95-4 | |
| Stepper motor driver | SongHe | TB6600 | |
| Sucrose | Bioshop | 57501 | |
| SW 41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Triton-X-100 | Bio-basic | 9002-93-1 | |
| Trizol | Thermofisher Scientific | 15596018 | |
| Tube piercer | Brandel | BR-184 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L8-70M | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| UNO project super starter kit | Elegoo | EL-KIT-003 | |
| UV monitor | Bio-Rad | EM-1 Econo | |
| Vertical bracket | Thorlabs | VB01A/M |
References
- Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).
- Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).
- Fiddes, I. T., et al. Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis. Cell. 173, 1356-1369 (2018).
- Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106, 404-420 (2020).
- Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).
- Amadei, G., et al. A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis. Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).
- Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program. Neuron. 84, 723-739 (2014).
- Yang, G., et al. A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring. Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).
- Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).
- Rodrigues, D. C., et al. Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells. Nature Communications. 11, 2018 (2020).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
- Chekulaeva, M., Landthaler, M. Eyes on translation. Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling. Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).
- Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).
- Kraushar, M. L., et al. Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes. Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).
