Analyse van vertaling in de zich ontwikkelende muishersenen met behulp van polysoomprofilering
Summary
De ontwikkeling van het zoogdierbrein vereist een goede controle van genexpressie op het niveau van vertaling. Hier beschrijven we een polysoomprofileringssysteem met een eenvoudig te assembleren sucrose gradiëntvormings- en fractioneringsplatform om de translationele status van mRNAs in de zich ontwikkelende hersenen te beoordelen.
Abstract
De juiste ontwikkeling van het zoogdierbrein is afhankelijk van een fijne balans van neurale stamcelproliferatie en differentiatie in verschillende neurale celtypen. Deze balans wordt strak gecontroleerd door genexpressie die op meerdere niveaus is verfijnd, waaronder transcriptie, posttranscriptie en vertaling. In dit opzicht benadrukt een groeiende hoeveelheid bewijs een cruciale rol van translationele regulatie bij het coördineren van beslissingen over het lot van neurale stamcellen. Polysoomfractie is een krachtig hulpmiddel voor de beoordeling van de mRNA-translationele status op zowel globaal als individueel genniveau. Hier presenteren we een interne polysomale profileringspijplijn om de translationele efficiëntie in cellen van de zich ontwikkelende hersenschors van muizen te beoordelen. We beschrijven de protocollen voor sucrose gradiëntvoorbereiding, weefsellysis, ultracentrifugatie en fractioneringsgebaseerde analyse van de mRNA-translationele status.
Introduction
Tijdens de ontwikkeling van de hersenen van zoogdieren verspreiden neurale stamcellen zich en differentiëren ze om neuronen en glia1,2 te genereren. De verstoring van dit proces kan leiden tot veranderingen in de hersenstructuur en -functie, zoals te zien is bij veel neuroontwikkelingsstoornissen3,4. Het juiste gedrag van neurale stamcellen vereist de georkestreerde expressie van specifieke genen5. Hoewel de epigenetische en transcriptiecontrole van deze genen intensief is bestudeerd, suggereren recente bevindingen dat genregulatie op andere niveaus ook bijdraagt aan de coördinatie van neurale stamcelproliferatie en differentiatie6,7,8,9,10. Het aanpakken van de translationele controleprogramma’s zal dus ons begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de beslissing over het lot van neurale stamcellen en de ontwikkeling van de hersenen aanzienlijk bevorderen.
Drie hoofdtechnieken met verschillende sterktes zijn op grote schaal toegepast om de translationele status van mRNA te beoordelen, waaronder ribosoomprofilering, het vertalen van ribosoomaffiniteitszuivering (TRAP) en polysoomprofilering. Ribosoomprofilering maakt gebruik van RNA-sequencing om ribosoombeveiligde mRNA-fragmenten te bepalen, waardoor de globale analyse van het aantal en de locatie van het vertalen van ribosomen op elk transcript indirect de vertaalsnelheid kan afleiden door het te vergelijken met transcriptie overvloed11. TRAP maakt gebruik van epitoop-gelabelde ribosomale eiwitten om ribosoomgebonden mRNAs te vangen12. Aangezien de gelabelde ribosomale eiwitten kunnen worden uitgedrukt in specifieke celtypen met behulp van genetische benaderingen, maakt TRAP de analyse van vertaling op een celtypespecifieke manier mogelijk. Ter vergelijking, polysoomprofilering, waarbij sucrosedichtheidsgradiëntfractie wordt gebruikt om vrije en slecht vertaalde porties (lichtere monosomen) te scheiden van die welke actief worden vertaald door ribosomen (zwaardere polysomen), biedt een directe meting van de ribosoomdichtheid op mRNA13. Een voordeel van deze techniek is de veelzijdigheid om de vertaling van specifiek mRNA van belang te bestuderen, evenals genoombrede vertaalanalyse14.
In dit artikel beschrijven we een gedetailleerd protocol van polysomale profilering om de zich ontwikkelende hersenschors van muizen te analyseren. We gebruiken een zelfgeassembleerd systeem om sucrosedichtheidsgradiënten voor te bereiden en fracties te verzamelen voor downstreamtoepassingen. Het hier gepresenteerde protocol kan eenvoudig worden aangepast om andere soorten weefsels en organismen te analyseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Polysomale profilering is een veelgebruikte en krachtige techniek om de translationele status te beoordelen op zowel single gene als genoombrede niveaus14 . In dit rapport presenteren we een protocol van polysomenprofilering met behulp van een thuisgeassembleerd platform en de toepassing ervan om de zich ontwikkelende muisschors te analyseren. Dit kosteneffectieve platform is eenvoudig te monteren en genereert robuuste, reproduceerbare sacharosegradiënten en polysoomprofilering met hoge gevoeligh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door een NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 to G.Y.). G.Y. is een Canada Research Chair. S.K. werd gefinancierd door Mitacs Globalink Graduate Fellowship en ACHRI Graduate Student Scholarship.
Materials
| 1.5 mL RNA free microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm dish | Greiner-Bio | 664160 | |
| 1M MgCl2 | Invitrogen | AM9530G | |
| 21-23G needle | BD | 305193 | |
| 2M KCl | Invitrogen | AM8640G | |
| 30 mL syringe | BD | 302832 | |
| Blunt end needle | VWR | 20068-781 | |
| Breadboard | Thorlabs | MB2530/M | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| CD1 mouse | Charles River Laboratory | ||
| Curved tip forceps | Sigma | #Z168785 | |
| Cycloheximide | Sigma | 66-81-9 | |
| Data acquisition software TracerDAQ | Measurement Computing | ||
| Digital converter | Measurement Computing | USB-1208LS | |
| Direct-zol RNA miniprep kit | Zymo | R2070 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-basic | 12-03-3483 | |
| DMSO | Bioshop | 67-68-5 | |
| Dumont No.5 forceps | Sigma | #F6521 | |
| Fraction collector | Bio-Rad | Model 2110 | |
| HBSS | Wisent | 311-513-CL | |
| Linear stage actuator | Rattmmotor | CBX1605-100A | |
| Luciferase control RNA | Promega | L4561 | |
| Maxima first strand cDNA synthesis kit | Themo Fisher | M1681 | |
| Miniature V-clamp | Thorlabs | VH1/M | |
| Mini-series breadboard | Thorlabs | MSB7515/M | |
| Mini-series optical post | Thorlabs | MS2R/M | |
| Mini-series pedestal post holder base | Thorlabs | MBA1 | |
| NaCl | Bio-basic | 7647-14-5 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| Ø12.7 mm aluminum post | Thorlabs | TRA150/M | |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| PerfeCTa SYBR green fastmix | Quanta Bio | CA101414-274 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Puromycin | Bioshop | 58-58-2 | |
| Right-angle clamp | Thorlabs | RA90/M | |
| Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp | Thorlabs | RA90TR/M | |
| Rnase AWAY | Molecular BioProducts | 7002 | |
| RNase free tips | Frogga Bio | FT10, FT200, FT1000 | |
| RNase free water | Wisent | 809-115-CL | |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| Slim right-angle bracket | Thorlabs | AB90B/M | |
| Small V-clamp | Thorlabs | VC1/M | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 302-95-4 | |
| Stepper motor driver | SongHe | TB6600 | |
| Sucrose | Bioshop | 57501 | |
| SW 41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Triton-X-100 | Bio-basic | 9002-93-1 | |
| Trizol | Thermofisher Scientific | 15596018 | |
| Tube piercer | Brandel | BR-184 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L8-70M | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| UNO project super starter kit | Elegoo | EL-KIT-003 | |
| UV monitor | Bio-Rad | EM-1 Econo | |
| Vertical bracket | Thorlabs | VB01A/M |
References
- Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).
- Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).
- Fiddes, I. T., et al. Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis. Cell. 173, 1356-1369 (2018).
- Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106, 404-420 (2020).
- Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).
- Amadei, G., et al. A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis. Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).
- Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program. Neuron. 84, 723-739 (2014).
- Yang, G., et al. A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring. Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).
- Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).
- Rodrigues, D. C., et al. Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells. Nature Communications. 11, 2018 (2020).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
- Chekulaeva, M., Landthaler, M. Eyes on translation. Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling. Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).
- Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).
- Kraushar, M. L., et al. Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes. Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).
