Summary

Analyse der Übersetzung im sich entwickelnden Mausgehirn mit Polysome Profiling

Published: May 22, 2021
doi:

Summary

Die Entwicklung des Säugetiergehirns erfordert eine ordnungsgemäße Kontrolle der Genexpression auf der Ebene der Translation. Hier beschreiben wir ein Polysomen-Profiling-System mit einer einfach zu montierenden Sucrose-Gradientenerstellungs- und Fraktionierungsplattform, um den Translationsstatus von mRNAs im sich entwickelnden Gehirn zu bewerten.

Abstract

Die richtige Entwicklung des Säugetiergehirns beruht auf einem feinen Gleichgewicht der proliferation neuronaler Stammzellen und der Differenzierung in verschiedene neuronale Zelltypen. Dieses Gleichgewicht wird streng durch genexpression kontrolliert, die auf mehreren Ebenen fein abgestimmt ist, einschließlich Transkription, Posttranskription und Übersetzung. In dieser Hinsicht unterstreicht eine wachsende Zahl von Beweisen eine entscheidende Rolle der translationalen Regulierung bei der Koordinierung von Entscheidungen über das Schicksal neuronaler Stammzellen. Polysome Fractionation ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Beurteilung des mRNA-Translationalstatus sowohl auf globaler als auch auf individueller Genebene. Hier stellen wir eine hauseigene Polysomen-Profiling-Pipeline vor, um die Translationseffizienz in Zellen aus der sich entwickelnden Mausgroßrinde zu bewerten. Wir beschreiben die Protokolle zur Saccharosegradientenvorbereitung, Gewebelyse, Ultrazentrifugation und Fraktionierungs-basierte Analyse des mRNA-Translationalstatus.

Introduction

Während der Entwicklung des Säugetierhirns vermehren sich neuronale Stammzellen und differenzieren sich, um Neuronen und Glia1,2 zu erzeugen. Die Störung dieses Prozesses kann zu Veränderungen in der Gehirnstruktur und -funktion führen, wie in vielen neuroentwicklungsbedingten Störungengesehen 3,4. Das richtige Verhalten neuronaler Stammzellen erfordert die orchestrierte Expression spezifischer Gene5. Während die epigenetische und transkriptionelle Kontrolle dieser Gene intensiv untersucht wurde, deuten jüngste Ergebnisse darauf hin, dass die Genregulation auf anderen Ebenen auch zur Koordination der Proliferation und Differenzierung neuronaler Stammzellen beiträgt6,7,8,9,10. Daher wird die Adressierung der translationalen Kontrollprogramme unser Verständnis der Mechanismen, die der Entscheidung über das Schicksal von neuronalen Stammzellen und der Entwicklung des Gehirns zugrunde liegen, erheblich voranbringen.

Drei Haupttechniken mit unterschiedlichen Stärken wurden weit verbreitet, um den Translationsstatus von mRNA zu bewerten, einschließlich Ribosom-Profiling, Übersetzen ribososome-Affinitätsreinigung (TRAP) und Polysome-Profiling. Ribosome Profiling verwendet RNA-Sequenzierung, um ribosome-geschützte mRNA-Fragmente zu bestimmen, was die globale Analyse der Anzahl und Position der Übersetzung von Ribosomen auf jedem Transkript ermöglicht, um indirekt die Translationsrate abzuleiten, indem man sie mit transkriptionsüberfluss11vergleicht. TRAP nutzt epitopgemarkierte ribosomale Proteine, um ribosomgebundene mRNAs12zu erfassen. Da die markierten ribosomalen Proteine mit genetischen Ansätzen in bestimmten Zelltypen exprimiert werden können, ermöglicht TRAP die zelltypspezifische Analyse der Translation. Im Vergleich dazu bietet die Polysomenprofilierung, die die Saccharosedichtegradientenfraktionierung verwendet, um freie und schlecht übersetzte Portionen (leichtere Monosomen) von denen zu trennen, die aktiv durch Ribosomen (schwerere Polysomen) übersetzt werden, eine direkte Messung der Ribosomdichte auf mRNA13. Ein Vorteil dieser Technik ist ihre Vielseitigkeit, die Übersetzung spezifischer mRNA von Interesse sowie genomweite Translatome-Analyse14zu studieren.

In diesem Artikel beschreiben wir ein detailliertes Protokoll der Polysomenprofilierung zur Analyse der sich entwickelnden Mausgroßhirnrinde. Wir verwenden ein selbst montiertes System, um Saccharosedichtegradienten vorzubereiten und Brüche für nachgelagerte Anwendungen zu sammeln. Das hier vorgestellte Protokoll kann leicht angepasst werden, um andere Arten von Geweben und Organismen zu analysieren.

Protocol

Der gesamte Gebrauch von Tieren wurde vom Animal Care Committee der University of Calgary überwacht. CD1-Mäuse, die für das Experiment verwendet wurden, wurden von kommerziellen Anbietern gekauft. 1. Vorbereitung von Lösungen HINWEIS Um den ABBAU der RNA zu verhindern, sprühen Sie die Werkbank und alle Geräte mit RNase-Dekontaminationslösung. Für das Experiment werden RNase-freie Spitzen verwendet. Alle Lösungen werden in RNase-freiem Wasser vorbereitet. …

Representative Results

Als Demonstration wurde das kortikale Lysat, das 75 g RNA (gepoolt aus 8 Embryonen) enthält, durch den Saccharosegradienten in 12 Fraktionen getrennt. Spitzen der UV-Absorption bei 254 nm identifizierten Fraktionen, die die 40S-Untereinheit, 60S-Untereinheit, 80S-Monosomen und Polysomen enthalten (Abbildung 4A). Die Analyse der Fraktionen nach Western Blot für die große ribosomale Untereinheit randalierte Rpl10 in der 60S-Untereinheit (Fraktion 3), Monosomen (Fraktion 4) und Polysomen (Fr…

Discussion

Polysome Profiling ist eine häufig verwendete und leistungsfähige Technik, um den Translationsstatus sowohl auf einzelnen Gen- als auch auf genomweiten Ebenen14 zu bewerten. In diesem Bericht stellen wir ein Protokoll der Polysomenprofilierung mit einer selbst zusammengesetzten Plattform und deren Anwendung zur Analyse des sich entwickelnden Mauskortex vor. Diese kostengünstige Plattform lässt sich einfach montieren und robuste, reproduzierbare Saccharosegradienten und Polysomenprofilierung mi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch einen NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 bis G.Y.) finanziert. G.Y. ist ein Canada Research Chair. S.K. wurde vom Mitacs Globalink Graduate Fellowship und dem ACHRI Graduate Student Scholarship finanziert.

Materials

1.5 mL RNA free microtubes Axygen MCT-150-C
10 cm dish Greiner-Bio 664160
1M MgCl2 Invitrogen AM9530G
21-23G needle BD 305193
2M KCl Invitrogen AM8640G
30 mL syringe BD 302832
Blunt end needle VWR 20068-781
Breadboard Thorlabs MB2530/M
Bromophenol blue Sigma 115-39-9
CD1 mouse Charles River Laboratory
Curved tip forceps Sigma #Z168785
Cycloheximide Sigma 66-81-9
Data acquisition software TracerDAQ Measurement Computing
Digital converter Measurement Computing USB-1208LS
Direct-zol RNA miniprep kit Zymo R2070
Dithiothreitol (DTT) Bio-basic 12-03-3483
DMSO Bioshop 67-68-5
Dumont No.5 forceps Sigma #F6521
Fraction collector Bio-Rad Model 2110
HBSS Wisent 311-513-CL
Linear stage actuator Rattmmotor CBX1605-100A
Luciferase control RNA Promega L4561
Maxima first strand cDNA synthesis kit Themo Fisher M1681
Miniature V-clamp Thorlabs VH1/M
Mini-series breadboard Thorlabs MSB7515/M
Mini-series optical post Thorlabs MS2R/M
Mini-series pedestal post holder base Thorlabs MBA1
NaCl Bio-basic 7647-14-5
Neurobasal media Gibco 21103-049
Ø12.7 mm aluminum post Thorlabs TRA150/M
Parafilm Bemis PM992
PerfeCTa SYBR green fastmix Quanta Bio CA101414-274
Phosphate buffered saline (PBS) Wisent 311-010-CL
Puromycin Bioshop 58-58-2
Right-angle clamp Thorlabs RA90/M
Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp Thorlabs RA90TR/M
Rnase AWAY Molecular BioProducts 7002
RNase free tips Frogga Bio FT10, FT200, FT1000
RNase free water Wisent 809-115-CL
RNasin Promega N2111
Slim right-angle bracket Thorlabs AB90B/M
Small V-clamp Thorlabs VC1/M
Sodium deoxycholate Sigma 302-95-4
Stepper motor driver SongHe TB6600
Sucrose Bioshop 57501
SW 41 Ti rotor Beckman Coulter 331362
Syringe pump Harvard Apparatus 70-4500
Syringe pump Harvard Apparatus 70-4500
Triton-X-100 Bio-basic 9002-93-1
Trizol Thermofisher Scientific 15596018
Tube piercer Brandel BR-184
Ultracentrifuge Beckman Coulter L8-70M
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 Invitrogen 15567-027
UNO project super starter kit Elegoo EL-KIT-003
UV monitor Bio-Rad EM-1 Econo
Vertical bracket Thorlabs VB01A/M

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Cite This Article
Kedia, S., Erickson, S. L., Yang, G. Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling. J. Vis. Exp. (171), e62088, doi:10.3791/62088 (2021).

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