पॉलीसोम प्रोफाइलिंग का उपयोग करके विकासशील माउस मस्तिष्क में अनुवाद का विश्लेषण
Summary
स्तनधारी मस्तिष्क के विकास के लिए अनुवाद के स्तर पर जीन अभिव्यक्ति के उचित नियंत्रण की आवश्यकता होती है। यहां, हम विकासशील मस्तिष्क में mRNAs की अनुवादात्मक स्थिति का आकलन करने के लिए एक आसान-से-इकट्ठा सुक्रोज ढाल बनाने और अंश मंच के साथ एक पॉलीसोम प्रोफाइलिंग सिस्टम का वर्णन करते हैं।
Abstract
स्तनधारी मस्तिष्क का उचित विकास तंत्रिका स्टेम सेल प्रसार और विभिन्न तंत्रिका कोशिका प्रकारों में भेदभाव के ठीक संतुलन पर निर्भर करता है। यह संतुलन जीन अभिव्यक्ति द्वारा कसकर नियंत्रित किया जाता है जो ट्रांसक्रिप्शन, पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शन और अनुवाद सहित कई स्तरों पर ठीक-ठाक है। इस संबंध में, साक्ष्य का एक बढ़ता हुआ निकाय तंत्रिका स्टेम सेल भाग्य निर्णयों के समन्वय में अनुवादात्मक नियमन की महत्वपूर्ण भूमिका पर प्रकाश डालता है । पॉलीसोम अंश वैश्विक और व्यक्तिगत जीन दोनों स्तरों पर एमआरएनए ट्रांसलेशनल स्थिति के आकलन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यहां, हम विकासशील माउस सेरेब्रल कॉर्टेक्स से कोशिकाओं में ट्रांसलेशनल दक्षता का आकलन करने के लिए एक इन-हाउस पॉलीसोम प्रोफाइलिंग पाइपलाइन पेश करते हैं। हम एमआरएनए ट्रांसलेशनल स्थिति के सुक्रोज रेडिएंट तैयारी, टिश्यू लाइसिस, अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन और आंशिक-आधारित विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Introduction
स्तनधारी मस्तिष्क के विकास के दौरान, तंत्रिका स्टेम कोशिकाएं न्यूरॉन्स और ग्लिया1,2 उत्पन्न करने के लिए पैदा होती हैं और अंतर करती हैं। इस प्रक्रिया के क्षोभ मस्तिष्क की संरचना और कार्य में परिवर्तन का कारण बन सकता है, जैसा कि कई न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों मेंदेखा जाता है 3,4। तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के उचित व्यवहार के लिए विशिष्ट जीन5की आर्केस्ट्रा अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है । जबकि इन जीनों के एपिजेनेटिक और ट्रांसक्रिप्शनल नियंत्रण का गहनता से अध्ययन किया गया है, हाल के निष्कर्षों से पता चलता है कि अन्य स्तरों पर जीन विनियमन भी तंत्रिका स्टेम सेल प्रसार और भेदभाव 6 ,7,8,9,10के समन्वय में योगदान देता है । इस प्रकार, अनुवाद नियंत्रण कार्यक्रमों को संबोधित बहुत तंत्रिका स्टेम सेल भाग्य निर्णय और मस्तिष्क के विकास अंतर्निहित तंत्र के बारे में हमारी समझ अग्रिम होगा ।
विभिन्न शक्तियों के साथ तीन मुख्य तकनीकों को व्यापक रूप से एमआरएनए की अनुवादात्मक स्थिति का आकलन करने के लिए लागू किया गया है, जिसमें राइबोसोम प्रोफाइलिंग, राइबोसोम आत्मीयता शुद्धिकरण (ट्रैप) और पॉलीसोम प्रोफाइलिंग का अनुवाद शामिल है। राइबोसोम प्रोफाइलिंग राइबोसोम-संरक्षित एमआरएनए टुकड़ों को निर्धारित करने के लिए आरएनए अनुक्रमण का उपयोग करता है, जिससे प्रत्येक ट्रांसक्रिप्ट पर राइबोसोम्स का अनुवाद करने की संख्या और स्थान के वैश्विक विश्लेषण को अप्रत्यक्ष रूप से अनुवाद दर का अनुमान लगाने की अनुमति मिलती है, जिसकी तुलना ट्रांसलेशन दर को ट्रांसक्रिप्ट बहुतायतसे 11से किया जाता है। ट्रैप राइबोसोम-बाउंड mRNAs12पर कब्जा करने के लिए epitope-टैग रिबोसोमल प्रोटीन का लाभ लेता है । यह देखते हुए कि टैग किए गए राइबोसोमल प्रोटीन को आनुवंशिक दृष्टिकोणों का उपयोग करके विशिष्ट सेल प्रकारों में व्यक्त किया जा सकता है, ट्रैप सेल प्रकार-विशिष्ट तरीके से अनुवाद के विश्लेषण की अनुमति देता है। इसकी तुलना में, पॉलीसोम प्रोफाइलिंग, जो रिबोसोम्स (भारी पॉलीसोम्स) द्वारा सक्रिय रूप से अनुवादित लोगों से मुक्त और खराब अनुवादित हिस्से (लाइटर मोनोसोम्स) को अलग करने के लिए सुक्रोज घनत्व ढाल का उपयोग करता है, mRNA13पर राइबोसोम घनत्व का प्रत्यक्ष माप प्रदान करता है। इस तकनीक का एक लाभ रुचि के विशिष्ट एमआरएनए के अनुवाद के साथ-साथ जीनोम-वाइड ट्रांसलिरोम विश्लेषण14का अध्ययन करना इसकी बहुमुखी प्रतिभा है।
इस पेपर में, हम विकासशील माउस सेरेब्रल कॉर्टेक्स का विश्लेषण करने के लिए पॉलीसोम प्रोफाइलिंग के विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम सुक्रोज घनत्व ढाल तैयार करने और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए अंश एकत्र करने के लिए घर-इकट्ठे प्रणाली का उपयोग करते हैं। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को अन्य प्रकार के ऊतकों और जीवों का विश्लेषण करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
पॉलीसोम प्रोफाइलिंग एक सामान्य रूप से उपयोग की जाने वाली और शक्तिशाली तकनीक है जो एकल जीन और जीनोम-वाइड दोनों स्तरों पर ट्रांसलेशनल स्थिति का आकलन करने के लिए14 है। इस रिपोर्ट में, हम विकासशील ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एनएसईआरसी डिस्कवरी ग्रांट (आरजीपिन/04246-2018 से जीवाई) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। जीवाई एक कनाडा अनुसंधान कुर्सी है । एस. के. को मितिक्स ग्लोबलिंक ग्रेजुएट फेलोशिप और अचरी ग्रेजुएट स्टूडेंट स्कॉलरशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।
Materials
| 1.5 mL RNA free microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm dish | Greiner-Bio | 664160 | |
| 1M MgCl2 | Invitrogen | AM9530G | |
| 21-23G needle | BD | 305193 | |
| 2M KCl | Invitrogen | AM8640G | |
| 30 mL syringe | BD | 302832 | |
| Blunt end needle | VWR | 20068-781 | |
| Breadboard | Thorlabs | MB2530/M | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| CD1 mouse | Charles River Laboratory | ||
| Curved tip forceps | Sigma | #Z168785 | |
| Cycloheximide | Sigma | 66-81-9 | |
| Data acquisition software TracerDAQ | Measurement Computing | ||
| Digital converter | Measurement Computing | USB-1208LS | |
| Direct-zol RNA miniprep kit | Zymo | R2070 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-basic | 12-03-3483 | |
| DMSO | Bioshop | 67-68-5 | |
| Dumont No.5 forceps | Sigma | #F6521 | |
| Fraction collector | Bio-Rad | Model 2110 | |
| HBSS | Wisent | 311-513-CL | |
| Linear stage actuator | Rattmmotor | CBX1605-100A | |
| Luciferase control RNA | Promega | L4561 | |
| Maxima first strand cDNA synthesis kit | Themo Fisher | M1681 | |
| Miniature V-clamp | Thorlabs | VH1/M | |
| Mini-series breadboard | Thorlabs | MSB7515/M | |
| Mini-series optical post | Thorlabs | MS2R/M | |
| Mini-series pedestal post holder base | Thorlabs | MBA1 | |
| NaCl | Bio-basic | 7647-14-5 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| Ø12.7 mm aluminum post | Thorlabs | TRA150/M | |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| PerfeCTa SYBR green fastmix | Quanta Bio | CA101414-274 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Puromycin | Bioshop | 58-58-2 | |
| Right-angle clamp | Thorlabs | RA90/M | |
| Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp | Thorlabs | RA90TR/M | |
| Rnase AWAY | Molecular BioProducts | 7002 | |
| RNase free tips | Frogga Bio | FT10, FT200, FT1000 | |
| RNase free water | Wisent | 809-115-CL | |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| Slim right-angle bracket | Thorlabs | AB90B/M | |
| Small V-clamp | Thorlabs | VC1/M | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 302-95-4 | |
| Stepper motor driver | SongHe | TB6600 | |
| Sucrose | Bioshop | 57501 | |
| SW 41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Triton-X-100 | Bio-basic | 9002-93-1 | |
| Trizol | Thermofisher Scientific | 15596018 | |
| Tube piercer | Brandel | BR-184 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L8-70M | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| UNO project super starter kit | Elegoo | EL-KIT-003 | |
| UV monitor | Bio-Rad | EM-1 Econo | |
| Vertical bracket | Thorlabs | VB01A/M |
References
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