मानकीकृत आंतों के लूप मॉडल का उपयोग करके चूहों में आंतों की पारगम्यता और न्यूट्रोफिल ट्रांसेपिथेलियल माइग्रेशन का कार्यात्मक मूल्यांकन
Summary
डिस्जेनिव आंतों के एपिथेलियल बैरियर फंक्शन और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं भड़काऊ आंत्र रोग की पहचान हैं जो शारीरिक मॉडलों की कमी के कारण खराब जांच करते रहते हैं। यहां, हम एक माउस आंतों के लूप मॉडल का वर्णन करते हैं जो वीवो में म्यूकोसल पारमेबिलिटी और ल्यूकोसिटे भर्ती का अध्ययन करने के लिए एक अच्छी तरह से संवहनी और बाहरी आंत्र खंड को नियोजित करता है।
Abstract
आंतों के म्यूकोसा को एपिथेलियल कोशिकाओं की एक परत से रेखांकित किया जाता है जो एक गतिशील बाधा बनाता है जो चमकदार बैक्टीरिया और बहिर्जात पदार्थों के पारित होने को रोकते हुए पोषक तत्वों और पानी के पैरासेलुलर परिवहन की अनुमति देता है। इस परत के उल्लंघन के परिणामस्वरूप चमकदार सामग्री और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती में पारमशीलता में वृद्धि होती है, जिनमें से दोनों भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) सहित आंत में रोगविज्ञानी राज्यों की पहचान हैं।
बहुरूपता न्यूक्लियर न्यूट्रोफिल (पीएमएन) के एपिथेलियल बैरियर फंक्शन और ट्रांसपेरियल माइग्रेशन (टीईपीएम) को विनियमित करने वाले तंत्र को मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देने वाले वीवो विधियों में प्रायोगिक की कमी के कारण अधूरा समझ में आता है। यहां, हम एक मजबूत मुरीन प्रयोगात्मक मॉडल का वर्णन करते हैं जो इलियम या समीपस्थ पेट के बाहरी आंतों के खंड को नियोजित करता है। बाहरी आंतों का पाश (iLoop) पूरी तरह से संवहनी है और पूर्व वीवो चैंबर-आधारित दृष्टिकोणों पर शारीरिक लाभ प्रदान करता है जो आमतौर पर एपिथेलियल सेल मोनोलेयर में पारमेबिलिटी और पीएमएन माइग्रेशन का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाते हैं।
हम इस मॉडल के दो अनुप्रयोगों को विस्तार से प्रदर्शित करते हैं: (1) इंट्राल्यूमिनल इंजेक्शन के बाद सीरम में फ्लोरेसेंस-लेबल डेक्सट्रांस का पता लगाने के माध्यम से आंतों की पारगम्यता का मात्रात्मक माप, (2) केमोटाट्रेक्टा के इंट्राल्यूमिनल परिचय के बाद आंतों के एपिथेलियम में माइग्रेट पीएमएन का मात्रात्मक आकलन। हम इस मॉडल की व्यवहार्यता प्रदर्शित करते हैं और नियंत्रण की तुलना में एपिथेलियल टाइट जंक्शन-संबद्ध प्रोटीन जैम-ए की कमी वाले चूहों में iLoop का उपयोग करने वाले परिणाम प्रदान करते हैं। जाम-ए भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के दौरान एपिथेलियल बैरियर फ़ंक्शन के साथ-साथ पीएमएन टीईएम को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है। iLoop का उपयोग करने वाले हमारे परिणाम पिछले अध्ययनों की पुष्टि करते हैं और होमोस्टेसिस और रोग के दौरान वीवो में आंतों की पारिम्यता और पीएमएन टीईपीएम के नियमन में जैम-ए के महत्व को उजागर करते हैं।
आईलूप मॉडल आंतों के होमोस्टेसिस और सूजन के वीवो अध्ययन में प्रजनन के लिए एक अत्यधिक मानकीकृत विधि प्रदान करता है और आईबीडी जैसे रोगों में आंतों के बाधा कार्य और म्यूकोसल सूजन की समझ में काफी वृद्धि करेगा।
Introduction
आंतों के म्यूकोसा में कॉलमर आंतों की एपिथेलियल कोशिकाओं (आईईसी), अंतर्निहित लैमिना प्रोप्रिया प्रतिरक्षा कोशिकाओं और मस्कुलरिस म्यूकोसे की एक परत शामिल है। पोषक तत्वों के अवशोषण में इसकी भूमिका के अलावा, आंतों के एपिथेलियम एक भौतिक बाधा है जो शरीर के इंटीरियर को ल्यूमिनल कॉमेंसल बैक्टीरिया, रोगजनकों और आहार एंटीजन से बचाता है। इसके अलावा, आईईसी और लैमिना प्रोप्रिया प्रतिरक्षा कोशिकाएं संदर्भ और उत्तेजनाओं के आधार पर सहिष्णुता या प्रतिक्रिया को प्रेरित करने वाली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का समन्वय करती हैं। यह सूचित किया गया है कि एपिथेलियल बैरियर का व्यवधान पैथोलॉजिक म्यूकोसल सूजन की शुरुआत से पहले हो सकता है और भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) में योगदान दे सकता है जिसमें अल्सर कोलाइटिस और क्रोन कीबीमारी1,2,3,4,5,6, 7शामिल हैं। अल्सर कोलाइटिस वाले व्यक्ति बहुरूपता न्यूक्लियर न्यूट्रोफिल (पीएमएन) के अत्यधिक ट्रांसेपिथेलियल माइग्रेशन (टीईएम) को क्रिप्ट फोड़े बनाते हैं, एक खोज जो रोग की गंभीरता से जुड़ी हुई है8,9। हालांकि समझौता एपीथेलियल बैरियर समारोह और अत्यधिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं IBD की पहचान कर रहे हैं, वहां वीवो परख में प्रयोगात्मक की कमी आंतों की पारिष्ठता और आंतों mucosa में प्रतिरक्षा कोशिका भर्ती के मात्रात्मक आकलन प्रदर्शन है ।
आंतों के एपिथेलियल पारीयता का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली सबसे आम विधियां और पीएमएन टीईएम ने अर्ध-पारमीयछिद्रीय झिल्ली आवेषण10, 11,12पर सुसंस्कृत आईईसी मोनोलेयर्स का उपयोग करके पूर्व वीवो चैंबर-आधारित दृष्टिकोणों को नियोजित किया। एपिथेलियल बैरियर अखंडता की निगरानी या तो ट्रांसेपिथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (टीईईआर) के माप या फ्लोरोसीन आइसोथियोसायनेट (फिटसी) के पैरासेलुलर फ्लक्स द्वारा की जाती है, जो एपिकल से बेसल डिब्बे13,14, 15के लिए डेक्सट्रान लेबल किया जाता है । इसी तरह, पीएमएन टीईपीएम का अध्ययन आमतौर पर निचले कक्ष16में जोड़े गए केमोएट्रेक्टेंट के जवाब में किया जाता है। पीएमएन को ऊपरी कक्ष में रखा जाता है और इनक्यूबेशन अवधि के बाद, बेसल डिब्बे में चले गए पीएमएन को एकत्र और मात्रा निर्धारित किया जाता है। हालांकि ये विधियां उपयोगी, प्रदर्शन करने में आसान और बहुत प्रजनन योग्य हैं, वे स्पष्ट रूप से न्यूनीकरणवादी दृष्टिकोण हैं और जरूरी नहीं कि वीवो स्थितियों में सटीक प्रतिबिंब का प्रतिनिधित्व करें।
चूहों में, आंतों की पैरासेलुलर पारिधि का अध्ययन करने के लिए एक आम परख फिटसी-डेक्सट्रान के मौखिक गैवरेज और रक्त सीरम13, 17में फिटसी-डेक्सट्रान उपस्थिति के बाद माप द्वारा है। इस परख का नुकसान यह है कि यह क्षेत्रीय आंतों के योगदान के बजाय गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट की समग्र बाधा अखंडता के आकलन का प्रतिनिधित्व करता है। इसके अलावा, इवांस ब्लू का उपयोग आमतौर पर वीवो 18 में संवहनी रिसाव का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है और माउस और चूहे19 , 20,21में आंतों के म्यूकोसल पारमेबिलिटी का मूल्यांकन करने के लिए भीनियोजितकिया गया है। आंतों म्यूकोसा में इवांस ब्लू के क्वांटिफिकेशन के लिए ऊतक से निष्कर्षण की आवश्यकता होती है जो रातभर फॉर्मामाइड में इनक्यूबेशन को नियोजित करता है। इसलिए, एक ही ऊतक का उपयोग आंतों के एपिथेलियल पारियटीयता और न्यूट्रोफिल घुसपैठ का अध्ययन करने के लिए नहीं किया जा सकता है।
यहां हम एक सरल प्रोटोकॉल को हाइलाइट करते हैं जो वीवो में कोलोनिक म्यूकोसल पारगम्यता और ल्यूकोसिटे ट्रांसेपिथेलियल माइग्रेशन पर प्रजनन योग्य डेटा एकत्र करने के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या को कम करता है। इसलिए, हम फिटसी-डेक्सट्रांस के उपयोग की सलाह देते हैं जो आंतों के छोरों की अखंडता से समझौता किए बिना रक्त सीरम में आसानी से पता लगाया जा सकता है जिसे आगे के विश्लेषण के लिए काटा जा सकता है। ध्यान दें, आंतों के लिगाटेड लूप का उपयोग विभिन्न प्रजातियों (माउस, चूहा, खरगोश, बछड़े सहित) में बैक्टीरियल संक्रमण (जैसे साल्मोनेला, लिस्टेरिया मोनोसाइटोजीन और एस्चेरिचिया कोलाई)22,23, 24,25 के साथ-साथ आंतों की पारगम्यता26का अध्ययन करने के लिए किया गया है; हालांकि, हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए आंत में विशिष्ट क्षेत्रों में पीएमएन टीईपीएम के तंत्र की जांच करने वाला कोई अध्ययन नहीं है जैसे कि आमतौर पर आईबीडी में शामिल हैं।
यहां हम माउस आंतों के लूप (iLoop) मॉडल का वर्णन करते हैं जो वीवो विधि में एक मजबूत और विश्वसनीय माइक्रोसर्जिकल है जो इलियम या समीपस्थ कोलन के एक अच्छी तरह से संवहनी और बाहरी आंतों के खंड को नियोजित करता है। iLoop मॉडल शारीरिक रूप से प्रासंगिक है और संज्ञाहरण के तहत जीवित चूहों पर आंतों की बाधा अखंडता और पीएमएन टीईएम के आकलन की अनुमति देता है। हम दो अनुप्रयोगों को प्रदर्शित करते हैं: 1) आईलूप 2 में इंट्राल्यूमिनल प्रशासन के बाद 4 केडीए फिटसी-डेक्सट्रान के सीरम स्तर का मात्राकरण) शक्तिशाली केमोट्राक्टाल्ट लेउकोट्रिन बी4 (एलटीबी4)27के इंट्राल्यूमिनल इंजेक्शन के बाद आईलूप ल्यूमेन में ट्रांसलॉल्ड पीएमएन का मात्राकरण । इसके अलावा, जैम-ए-नलचूहों या चूहों के साथ आईलूप मॉडल का उपयोग आईईईसी (विल्लिन-क्रे) पर जाम-ए के चयनात्मक नुकसान को शरणदेते हैं; जाम-ए fl/fl)नियंत्रण चूहों की तुलना में, हम पिछले अध्ययनों की पुष्टि करने में सक्षम हैं जिन्होंने टाइट जंक्शन से जुड़े प्रोटीन जैम-ए से आंतों की पारगम्यता और न्यूट्रोफिल ट्रांसमिग्रेशन15,28, 29,30, 31के लिए एक प्रमुख योगदान की सूचना दी है ।
iLoop मॉडल एक अत्यधिक कार्यात्मक और शारीरिक विधि है जिसका उपयोग विट्रो परख की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, यह एक बहुमुखी प्रयोगात्मक मॉडल है जो विभिन्न अभिकर्षकों के अध्ययन की अनुमति देता है जिन्हें लूप ल्यूमेन में इंजेक्ट किया जा सकता है, जिसमें केमोकिन, साइटोकिन्स, बैक्टीरियल रोगजनक, विषाक्त पदार्थ, एंटीबॉडी और चिकित्सीय शामिल हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
आईबीडी जैसी रोगजनक परिस्थितियों में आंतों के बैरियर फंक्शन और प्रतिरक्षा सेल भर्ती के डिस्रेगुलेशन के लिए जिम्मेदार तंत्र को अधूरा समझ में आ जाता है। यहां, हम वीवो मुरीन मॉडल में एक मजबूत विस्तार करत?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने वूर्जबर्ग विश्वविद्यालय के डॉ स्वेन फ्लेमिंग को समीपस्थ पेट लूप मॉडल की स्थापना में उनके योगदान के लिए धन्यवाद दिया, माउस उपनिवेशों के प्रबंधन के लिए शॉन वाटसन और चिथरा के मुरम्लेधरन ने आईलूप मॉडल के चित्रों के अधिग्रहण में मदद करने के लिए । इस काम को जर्मन रिसर्च फाउंडेशन/डीएफजी (बीओ 5776/2-1) से केबी, R01DK079392, R01DK072564, और R01DK061379 से C.A.P.
Materials
| Equipment and Material | |||
| BD Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8" | BD | 305122 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2" | BD | 305106 | |
| BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle | BD | 309659 | |
| 15ml Centrifuge Tube | Corning | 14-959-53A | |
| Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate | FisherScientific | 07-200-592 | |
| Corning Non-treated Culture Dish, 10cm | MilliporeSigma | CLS430588 | |
| Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile | FisherScientific | 25806 2WC | |
| Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2" | Medex | 3249-1 | |
| EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units) | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Falcon Centrifuge Tube 50ml | VWR | 21008-940 | |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | FisherScientific | 15-901-10R | |
| Halsey Needle Holder (needle holder) | FST | 12001-13 | |
| Kimwipes, small (tissue wipe) | FisherScientific | 06-666 | |
| 1.7ml Microcentrifuge Tubes | Thomas Scientific | c2170 | |
| Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube) | Sarstedt | 41.1501.105 | |
| Moria Fine Scissors | FST | 14370-22 | |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh) | Falcon | 352235 | |
| Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant | Dechra | 12920060 | |
| Ring Forceps (blunt tissue forceps) | FST | 11103-09 | |
| Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD | FisherScientific | NC9452680 | |
| Semken Forceps (anatomical forceps) | FST | 1108-13 | |
| Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting | HenrySchein | SS694 | |
| Student Fine Forceps, Angled | FST | 91110-10 | |
| 10ml Syringe PP/PE without needle | Millipore Sigma | Z248029 | |
| 96 Well Cell Culture Plate | Corning | 3799 | |
| Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm | Instech | FTP-20-30 | |
| Solutions and Buffers | |||
| Accugene 0.5M EDTA | Lonza | 51201 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Corning | 21-023-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8) | BioLegend | 127610 | |
| CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70) | ThermoFisher | 12-0112-81 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Invitrogen | C36950 | |
| Dithiotreitol | FisherScientific | BP172-5 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | R&D Systems | 511550 | |
| Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000 | Sigma | 60842-46-8 | |
| Isoflurane | Halocarbon | 12164-002-25 | |
| Leukotriene B4 | Millipore Sigma | 71160-24-2 | |
| PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11) | BD Pharmingen | 557235 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block) | BD Bioscience | 553142 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05 | |
| Recombinant Murine TNF-α | Peprotech | 315-01A |
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