Trapianto di isole ricoperte di grasso utilizzando tessuto adiposo bianco epididimo

Summary

Questo metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso è adatto per il rilevamento di isole innestate nella cavità intraperitoneale. In particolare, non richiede l’uso di agenti bioleganti o sutura.

Abstract

Il trapianto di isole è una terapia cellulare sostitutiva per il diabete mellito grave. La cavità intraperitoneale è tipicamente il sito di trapianto per questa procedura. Tuttavia, il trapianto di isole intraperitoneali presenta alcune limitazioni, tra cui la scarsa efficacia del trapianto, la difficile capacità di rilevamento dell’innesto e la mancanza di capacità di graftectomia per l’analisi post-trapianto. In questo articolo, “trapianto di isole ricoperte di grasso”, un metodo di trapianto di isole intraperitoneali che utilizza tessuto adiposo bianco epididimale, viene utilizzato per valutare gli effetti terapeutici delle isole bioingegnerizzate. La semplicità del metodo sta nella semina di isole sul tessuto adiposo bianco dell’epididimo e nell’utilizzo del tessuto per coprire le isole. Mentre questo metodo può essere classificato come una tecnica di trapianto di isole intraperitoneali, condivide le caratteristiche con il trapianto di isole di tessuto intra-adiposo. Tuttavia, il metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso dimostra effetti terapeutici più robusti rispetto al trapianto di isole di tessuto intra-adiposo, compreso il miglioramento dei livelli di glucosio nel sangue e di insulina plasmatica e il potenziale di rimozione del trapianto. Si consiglia l’adozione di questo metodo per valutare i meccanismi di attecchimento delle isole nel tessuto adiposo bianco e gli effetti terapeutici delle isole bioingegnerizzate.

Introduction

Il trapianto di isole è una terapia cellulare sostitutiva per i pazienti con diabete mellito grave. Recenti rapporti hanno dimostrato che i tassi di insulino-indipendenza a tre anni dal trapianto migliorano fino al 44%¹ e che circa l’80% dei riceventi che ricevono più di 600.000 equivalenti insulari totali raggiungono l’insulino-indipendenza². Inoltre, nel più recente rapporto del Collaborative Islet Transplant Registry, è stato rivelato che i livelli di glucosio nel sangue a digiuno sono stati mantenuti a 60-140 mg / dL per un periodo di 5 anni in oltre il 70% dei pazienti sottoposti a trapianto di isole da solo. Lo studio ha anche determinato che circa il 90% dei pazienti che hanno ricevuto il trapianto di isole da solo o il trapianto di isole dopo trapianto di rene non hanno sviluppato eventi ipoglicemici gravi per oltre 5 anni³.

Sebbene i risultati clinici di questo trattamento siano migliorati, alcune limitazioni devono ancora essere affrontate, inclusa la necessità di stabilire un sito di trapianto ottimale. Il fegato è un tipico sito di trapianto per il trapianto di isole cliniche perché è l’organo più grande che può ospitare un elevato volume di isole. Tuttavia, in alcuni pazienti il fegato non è disponibile (ad esempio, a causa di ipertensione portale, epatite e / o cirrosi⁴) e quindi altri siti, tra cui lo spazio subcapsulare renale^5,6, la sacca omentale 7,8,9,10, il mesentere 11, il tratto gastrointestinale 12, il muscolo scheletrico 13, il tessuto sottocutaneo 13^, il midollo osseo¹⁴ e la milza ¹⁵ ,^16,17, sono stati considerati come siti di trapianto alternativi.

Sebbene il trapianto intraperitoneale di isole possa essere eseguito facilmente in anestesia locale, rendendo la cavità intraperitoneale un sito attraente per il trapianto clinico di isole, al momento del trapianto, le isole sono disperse in tutta la cavità intraperitoneale, rendendo difficile il rilevamento dell’attecchimento delle isole e la conferma dell’attecchimento di successo. Pertanto, la cavità intraperitoneale non è ampiamente riconosciuta come sito di trapianto clinico ideale. Invece, è spesso utilizzato come modello di controllo per studi preclinici per studiare l’efficacia delle isole trapiantate incapsulate¹⁸ e bioingegnerizzate¹⁹. Tuttavia, un confronto esatto tra isole bioingegnerizzate e di controllo è difficile da ottenere a causa delle difficoltà nell’eseguire una valutazione accurata dell’attecchimento.

Al contrario, l’uso di tessuto adiposo bianco intraperitoneale nella sacca omentale⁸, nel mesentere e in altre sedi extraepatiche è stato ben riportato 10,20,21,22,23 e molti degli studi che hanno studiato la funzione delle isole bioingegnerizzate trapiantate utilizzando tessuto adiposo bianco sono stati in grado di riportare risultati terapeutici promettenti^{20,24,25, 26}. Poiché l’uso del tessuto adiposo epididimo facilita la rilevazione delle isole trapiantate, il “metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso”, utilizzando tessuto adiposo epididimale, è stato sviluppato per superare i limiti del trapianto di isole intraperitoneali. In questo articolo viene descritto il trapianto di isole ricoperte di grasso utilizzando tessuto adiposo epididimale.

Protocol

La procedura seguente viene eseguita in tre passaggi. Il primo passo include l’induzione del diabete nei topi riceventi e l’isolamento delle isole donatrici. Il secondo passo prevede la preparazione delle isole prima del trapianto. Nella terza fase, viene eseguito il trapianto di isole sul tessuto adiposo epididimo e la copertura delle isole utilizzando il tessuto adiposo. Successivamente, sono stati valutati gli effetti terapeutici. La manipolazione dei topi e le procedure sperimentali eseguite in questo studio sono con…

Representative Results

Per confrontare l’efficacia del trapianto di isole ricoperte di grasso con quella dopo il trapianto di isole intraperitoneali, lo stesso numero di isole è stato impiantato sul peritoneo nello spazio paracolico sinistro degli animali diabetici riceventi di controllo. I livelli di glucosio nel sangue dei topi con trapianto di isole ricoperte di grasso sono stati osservati diminuire gradualmente e significativamente rispetto ai topi trapiantati di isole intraperitoneali (p = 0,0023; Figura 3A)…

Discussion

Il metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso incorpora tecniche di due diverse tecniche di trapianto: trapianto di isole intraperitoneali e trapianto di isole di tessuto intra-adiposo. Poiché la membrana superficiale del tessuto adiposo bianco dell’epididimo è considerata il tessuto adiposo bianco coperto dal peritoneo e che è attaccato all’epididimo, il metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso può essere anatomicamente classificato come un tipo di trapianto di isole intraperitoneali. La tecnica con cu…

Materials

4-0 Nylon	Alfresa	ER2004NA45-KF2	Closing abdomen
Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig	Jackson Immunoresearch	706-546-148	Secondary antibody for insulin antibody
Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	711-606-152	Secondary antibody for von Willebrand factor antibody
DMEM, low glucose, pyruvate	ThermoFisher Scientific	11885084	Culturing islets, transplanting islets
Eosin	Fujifilm Wako Chemicals	051-06515	Using for staining tissue by eosin
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL	Eppendorf	30120086	Collecting islets
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352095	Collecting islets
Falcon 40 µm Cell Strainer	Falcon	352340	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352070	Discarding excessive medium/buffer
Guinea pig anti-insulin	Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako)	IR002	Primary antibody for murine insulin
Hematoxylin	Muto Pure Chemicals Co., Ltd.	30002	Using for staining tissue by hematoxylin
Isodine solution 10%	Shionogi&Co., Ltd.	no catalog number	Using for disinfection
Isoflurane	Fujifilm Wako Chemicals	095-06573	Using for anesthesia
Labcon 1000 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips	Labcon	1177-965-008	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Labcon 200 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips	Labcon	1179-965-008	Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Mintsensor	Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd.,	8AEB02E	Using for monitoring blood glucose
Pipetteman P-1000	Gilson	F123602	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Pipetteman P-200	Gilson	F123601	Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Rabbit anti-vWF	Abcam	ab6994	Primary antibody for murine von Willebrand factor