تصور التكيفات الخلوية الرئة خلال الأوزون المشترك وLPS الناجمة عن إصابة الرئة مورين الحادة
Summary
تظهر الفئران المتعرضة للأوزون والبكتيريا مجتمعة موت الخلايا واسع الانتشار، بما في ذلك موت العدلات. لاحظنا التكيفات الخلوية مثل تعطيل اللاميلبوديا الهيكل الخلوي، وزيادة التعبير الخلوي من وحدة فرعية V ATP synthase المعقدة β والأنجيوستاتين في الحمم الهوائية القصبية، وقمع الاستجابة المناعية الرئة وتأخير تجنيد العدلات.
Abstract
تواجه الرئتين باستمرار الإهانات المباشرة وغير المباشرة في شكل حالات التهابية معقمة (جزيئات أو سموم تفاعلية) ومعدية (بكتيرية أو فيروسية أو فطرية). قد تؤدي استجابة المضيف الساحقة إلى تعرض التنفس للخطر وإصابة الرئة الحادة ، والتي تتميز بتوظيف العدلات الرئوية نتيجة للاستجابة المناعية المضيفة المنطقية المرضية والتخثرية وإعادة عرض الأنسجة. تعتبر الطرق المجهرية الحساسة لتصور وقياس التكيفات الخلوية الرئوية المورينية ، استجابة للأوزون منخفض الجرعة (0.05 صفحة في المليون) ، وهو ملوث بيئي قوي بالاشتراك مع شحم الدهون البكتيري ، وهو ناهض TLR4 ، حاسمة من أجل فهم آليات الالتهاب والإصلاح المضيفة. نحن نصف تحليل مجهري فلوري شامل لمختلف مقصورات الرئة والجسم الجهازية ، وهي سائل الحمم الهوائية الحويصلات ، وثقب الأوعية الدموية الرئوية ، والتبريد الرئوي الأيسر ، وثقب نخاع العظم القصي. نظهر تلف الضامة السنفية ، العدلات ، الأنسجة الرئوية ، وكذلك خلايا نخاع العظام في ارتباط مع استجابة مناعية متأخرة (تصل إلى 36-72 ساعة) تتميز بتدرجات chemokine منفصلة في المقصورات التي تم تحليلها. وبالإضافة إلى ذلك، نقدم مصفوفة الرئة خارج الخلية والتفاعلات الخلوية الخلوية الخلوية (أكتين، توبولين)، الميتوكوندريا وأنواع الأكسجين التفاعلية، البلازمينوجين المضادة للتخثر، وشظايا الببتيد المضادة للأجيوجين أنجيوستاتين، والميتوكوندريا ATP synthase مجمع V الوحدات الفرعية، α β. هذه العلامات البديلة، عندما تستكمل مع المقايسات الكافية في المختبر القائم على الخلايا وتقنيات التصوير الحيواني في الجسم الحي مثل المجهر داخل الجسم، يمكن أن توفر معلومات حيوية نحو فهم استجابة الرئة لعوامل المناعة الجديدة.
Introduction
إصابة الرئة الحادة (ALI) هي استجابة مرضية حاسمة للرئتين للمحفزات المعدية أو غيرها من المحفزات الضارة التي تتميز بالتنشيط المتزامن للجهاز المناعي التخثري والشظي والفطري1. العدلات الشعور على الفور الميكروبات وكذلك أنماط الضرر داخل الخلايا من خلال مستقبلات مثل حصيلة (TLR) الأسرة2،3،4. تطلق العدلات السيتوكينات مسبقة التشكيل ومحتويات الحبيبات السامة للخلايا ، والتي يمكن أن تسبب بعد ذلك تلفا جانبيا في الأنسجة. ويشوب الضرر السنفي الذي أعقب ذلك مع موت الخلايا الثانوية مما يؤدي إلى إطلاق جزيئات مثل أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)5، وبالتالي وضع في حلقة مفرغة من خلل التنظيم المناعي.
مشكلة لم تحل في فهم ALI تتعلق بمسألة كيفية بدء الإصابة داخل الغشاء الحويصلي. مجمع نقل الإلكترون V، F1F0 ATP synthase، هو بروتين الميتوكوندريا المعروف أن أعرب في كل مكان، على الخلية (بما في ذلك البطانية، الكريات البيض، الظهارية) غشاء البلازما أثناء الالتهاب. هيكل الخلية الخلوي الذي يتكون من أكتين وتوبولين، يؤوي العديد من شكل الخلية وتعديل الوظائف وكذلك البروتينات الميتوكوندريا، على التوالي. لقد أظهرنا مؤخرا أن الحصار المفروض على SYNTHASE ATP بواسطة جزيء داخلي، أنجيوستاتين، يسكت تجنيد العدلات، والتنشيط وlipopolysaccharide (LPS) الناجم عن التهاب الرئة6. وهكذا، قد تنظم كل من الآليات الكيميائية الحيوية (ATP synthase) والمناعة (TLR4) حاجز الحويصلات أثناء التهاب الرئة.
التعرض للأوزون (O3)،وهو ملوث بيئي، يضعف وظائف الرئة، ويزيد من التعرض للالتهابات الرئوية، ومستويات منخفضة قصيرة من التعرض O3 تزيد من خطر الوفيات في أولئك الذين يعانون من أمراض القلب والجهاز التنفسي الكامنة7،8،9،10،11،12،13،14. وهكذا، والتعرض لتركيزات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية من O3 يوفر نموذجا ذا مغزى من ALIلدراسةالآليات الأساسية للالتهاب 7،8. وقد أنشأت مختبرنا مؤخرا نموذج مورين من جرعة منخفضة O3 المستحثة ALI15. بعد إجراء جرعة والاستجابة الزمنية لتركيزات O3 منخفضة، لاحظنا أن التعرض ل0.05 ppm O3 لمدة 2 ساعة، يؤدي إلى إصابة الرئة الحادة التي تتميز الرئة ATP synthase مجمع β الفرعي الخامس (ATPа) والتعبير أنجيوستاتين، على غرار نموذج LPS. كشف التصوير الرئوي داخل الفيتية عدم تنظيم ال أكتين الحويصلات الدقيقة التي تشير إلى تلف الرئة، واجتثاث من أنواع الأكسجين التفاعلي الحاجز السني (ROS) مستويات (مما يدل على إلغاء إشارات الخلايا الأساسية) وإمكانات غشاء الميتوكوندريا (مما يشير إلى موت الخلايا الحادة) بعد التعرض 2 ساعة إلى 0.05 جزء في المليون O315 التي ترتبط مع الرئة غير المتجانسة 18FDG الاحتفاظ16،تجنيد العدلات وإطلاق السيتوكين، أبرزها IL-16 و SDF-1α. الرسالة التي تحظى بها دراساتنا الحديثة هي أن O 3 ينتجسمية عالية بشكل كبير عند التعرض بتركيزات أقل من الحدود المسموح بها البالغة 0.063 جزء في المليون أكثر من 8 ساعة (يوميا) للتعرض البشري. الأهم من ذلك ، لا يوجد فهم واضح حول ما إذا كانت هذه التعرضات دون السريرية O3 يمكن أن تعدل الآليات بوساطة TLR4 مثل السموم الداخلية البكتيرية17. وهكذا، درسنا نموذج التعرض O3 وLPS مزدوجة الضرب ولاحظنا التكيفات الخلوية المناعية وغير المناعية.
نحن نصف تحليل مجهري فلوري شامل لمختلف مقصورات الرئة والجسم الجهازية ، وهي سائل الحمم الهوائية الهوائية (أي ، BAL) الذي عينات من المساحات السنفية، وتغلغل الأوعية الدموية الرئة (أي LVP) أن عينات الأوعية الدموية الرئوية وانترستيتيوم الحاجز السنفي في حالة وجود حاجز البطانية للخطر، والتبريد الرئة اليسرى، للنظر في الكريات البيض parenchymal المقيمين وأتباع اليسار في أنسجة الرئة المحمى ، الدم المحيطي الذي يمثل الكريات البيض المتداولة ونخاع عظم القص والفخذ التي تتذوق المواقع القريبة والبادئة لتعبئة الخلايا الدموية أثناء الالتهاب ، على التوالي.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأساليب المعروضة في الدراسة الحالية تسليط الضوء على فائدة تحليل مقصورة متعددة لدراسة الأحداث الخلوية متعددة أثناء التهاب الرئة. وقد لخصنا النتائج في الجدول 2. وقد درسنا نحن والعديد من المختبرات على نطاق واسع استجابة المورين لغرس LPS داخل الجهاز الداخلي ، والذي يتميز بالتوظيف الس…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم تمويل البحث الذي أجري من خلال منحة الرئيس NSERC بالإضافة إلى أموال بدء التشغيل من مركز سيلفيا فيدوروك الكندي للابتكار النووي. يتم تمويل مركز سيلفيا فيدوروك الكندي للابتكار النووي من قبل الابتكار ساسكاتشوان. تم إجراء التصوير الفلوري في مركز التصوير WCVM ، الذي تموله NSERC. تم تمويل جيسيكا بروكوس (طالبة MSc) وManpreet Kaur (طالبة MSc) من أموال بدء التشغيل من مركز سيلفيا فيدوروك الكندي للابتكار النووي.
Materials
| 33-plex Bioplex chemokine panel | Biorad | 12002231 | |
| 63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives | Leica | HCX PL APO CS (11506188) | |
| Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11045 | |
| Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11002 | |
| Alexa 488 conjugated phalloidin | Invitrogen | A12370 | |
| Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A | Millipore | 05-829X-555 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) | Invitrogen | A21112 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | |
| Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21070 | |
| Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa | BD Pharmingen | 553343 | |
| C57BL/6 J Mice | Jackson Laboratories | 64 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Leica TCS SP5 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | D1306 | aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C |
| Inverted fluorescent wide field microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Ketamine (Narketan) | Vetoquinol | 100 mg/ml | Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock |
| Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) | Invitrogen | 459240 | |
| Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) | Invitrogen | A-21351 | |
| Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) | Invitrogen | 16-5941-82 | |
| Pierce 660 nm protein assay | Thermoscientific | 22660 | |
| Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG | Abcam | ab2904 | |
| Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) | Invitrogen | 14-6093-81 | |
| Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) | Invitrogen | 16-9668-82 | |
| Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 53-5931-82 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) | BD Pharmingen | 553142 | |
| Reduced mitotracker orange | Invitrogen | M7511 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 20 mg/ml | Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock |
References
- Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).
- Aulakh, G. K. Neutrophils in the lung: “the first responders”. Cell Tissue Research. , (2017).
- Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).
- Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).
- Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).
- Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils. Cell Tissue Research. , (2013).
- Cakmak, S., et al. Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone. Environment International. 111, 200-211 (2018).
- Dauchet, L., et al. Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults. Environment International. 121, 610-619 (2018).
- Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).
- Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects. Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).
- Rush, B., et al. Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome. Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).
- Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States. Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).
- Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada. Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).
- Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone. Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).
- Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury. Physiological Reports. 8 (11), 14463 (2020).
- Aulakh, G. K., et al. Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging. Scientific Reports. 10 (1), 15699 (2020).
- Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, 24 (2008).
- Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
- Southam, D. S., Dolovich, M., O’Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).
- Aulakh, G. K. Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation. Cell Tissue Research. , (2020).
- Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
- Yipp, B. G., et al. The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection. Science Immunology. 2 (10), (2017).
- Lee, T. Y., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
- Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications. Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).
- Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). 생화학. 54 (33), 5185-5197 (2015).
- Oosting, R. S., et al. Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells. American Journal of Physiology. 262 (1), 63-68 (1992).
- Roth, S., et al. Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol. Cell Death & Discovery. 1, 15056 (2015).
- Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development. Cells. 8 (2), (2019).
- Gupta, A., et al. Extrapulmonary manifestations of COVID-19. Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).
- Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. . 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).
- Aulakh, G. K., et al. Multiple image x-radiography for functional lung imaging. Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009 (2018).
