Visualisering lungcellulære tilpasninger under kombineret ozon og LPS induceret Murine akut lungeskade
Summary
Kombineret ozon og bakteriel endotoxin eksponerede mus viser udbredt celledød, herunder neutrofiler. Vi observerede cellulære tilpasninger såsom forstyrrelse af cytoskeletal lamellipodia, øget cellulær ekspression af komplekse V ATP-syntetiserende underenhed β og angiostatin i broncho-alveolar-lavage, undertrykkelse af lunge immunrespons og forsinket neutrofil rekruttering.
Abstract
Lungerne står konstant over for direkte og indirekte fornærmelser i form af sterile (partikler eller reaktive toksiner) og infektiøse (bakterielle, virale eller svampe) inflammatoriske tilstande. En overvældende vært respons kan resultere i kompromitteret åndedræt og akut lungeskade, som er karakteriseret ved lunge neutrofil rekruttering som følge af pato-logisk vært immun, koagulativ og væv remodeling respons. Følsomme mikroskopiske metoder til at visualisere og kvantificere murin lunge cellulære tilpasninger, som reaktion på lav dosis (0,05 ppm) ozon, en potent miljøforurenende stof i kombination med bakteriel lipopolysaccharid, en TLR4 agonist, er afgørende for at forstå værten inflammatoriske og reparation mekanismer. Vi beskriver en omfattende fluorescerende mikroskopisk analyse af forskellige lunge-og systemiske kropsrum, nemlig broncho-alveolar lavage væske, lunge vaskulær perfusate, venstre lunge cryosections, og brystbenet knoglemarv perfusate. Vi viser skader på alveolar makrofager, neutrofiler, lungeparenchymalt væv samt knoglemarvsceller i korrelation med et forsinket (op til 36-72 h) immunrespons, der er præget af diskrete kemokingradienter i de analyserede rum. Derudover præsenterer vi lunge ekstracellulær matrix og cellulære cytoskeletale interaktioner (actin, tubulin), mitokondrie og reaktive iltarter, antikoagulativ plasminogen, dens anti-angiogene peptidfragment angiostatin, mitokondrie ATP-synthasekomplekset V-underenheder, α og β. Disse surrogat markører, når suppleret med tilstrækkelig in vitro celle-baserede assays og in vivo dyr billeddannelse teknikker såsom intravital mikroskopi, kan give vigtige oplysninger til at forstå lungerespons på nye immunmodulatoriske midler.
Introduction
Akut lungeskade (ALI) er en afgørende patologisk reaktion fra lungerne på infektiøse eller andre skadelige stimuli, som er præget af samtidig aktivering af koagulativt, fibrinolytisk og medfødt immunforsvar1. Neutrofiler hurtigt forstand mikrobielle samt intracellulære skader mønstre gennem Toll-lignende receptor (TLR) familie2,3,4. Neutrofiler frigiver præfabrikerede cytokiner og cytotoksisk granulatindhold, som derefter kan forårsage skader på væv i sikkerhedsstillelse. Den efterfølgende alveolar skade er skæmmet med sekundær celledød, der fører til frigivelse af molekyler som adenosin triphosphat (ATP)5, og dermed indstilling i en ond cirkel af immun-dysregulering.
Et uløst problem i forståelsen af ALI vedrører spørgsmålet om, hvordan skaden er indledt inden for alveolarmembranen. Elektrontransportkomplekset V, F1F0 ATP-synthase, er et mitokondrieprotein, der vides at udtrykkes allestedsnærværende, på celle (herunder endotel, leukocyt, epitel) plasmamembran under inflammation. Cellen cytoskeleton, som består af actin og tubulin, huser mange celleform og funktion modulerende samt mitokondrie proteiner, henholdsvis. Vi har for nylig vist, at blokade af ATP-synthase af et endogent molekyle, angiostatin, tavsheder neutrofil rekruttering, aktivering og lipopolysaccharid (LPS) induceret lungebetændelse6. Således kan både biokemiske (ATP-synthase) og immunmekanismer (TLR4) regulere alveolarbarrieren under lungebetændelse.
Udsættelse for ozon (O3), et miljøforurenende stof, svækker lungefunktionen, øger modtageligheden for lungeinfektioner, og korte lave niveauer af O3-eksponeringer øger risikoen for dødelighed hos personer med underliggende kardiorespiratoriske tilstande7,8,9,10,11,12,13,14. Således giver eksponering for fysiologisk relevantekoncentrationer af O 3 en meningsfuld model af ALI til undersøgelse af grundlæggende mekanismer forinflammation 7,8. Vores laboratorium har for nylig etableret en murine model af lav-dosis O3 induceret ALI15. Efter at have udført en dosis og tidsrespons på lave O3-koncentrationer observerede vi, at eksponering for 0,05 ppm O3 i 2 timer fremkalder akut lungeskade, der er præget af lunge ATP-synthasekomplekset V-underenhed β (ATPβ) og angiostatinudtryk, svarende til LPS-modellen. Intravital lunge billeddannelse afslørede uorganisering af alveolar actin mikrofilamenter angiver lungeskader, og ablation af alveolar septal reaktive iltarter (ROS) niveauer (angiver abrogation af baseline celle signalering) og mitokondriemembran potentiale (angiver akut celledød) efter 2 timers eksponering for 0,05 ppm O315, som korreleret med en heterogen lunge 18FDG retention16, neutrophil rekruttering og cytokin frigivelse, især IL-16 og SDF-1α. Hjemmebudskabet fra vores seneste undersøgelser er, at O3 producerer eksponentielt høj toksicitet, når de udsættes for koncentrationer under de tilladte grænser på 0,063 ppm over 8 timer (pr. dag) for menneskelig eksponering. Det er vigtigt, at der ikke er nogen klar forståelse af, om disse subkliniske O3-eksponeringer kan modulere TLR4-medierede mekanismer som ved bakteriel endotoxin17. Således har vi studeret en dual-hit O3 og LPS eksponering model og observerede immunforsvaret og ikke-immune cellulære tilpasninger.
Vi beskriver en omfattende fluorescerende mikroskopisk analyse af forskellige lunge- og systemiske karrosserirum, nemlig broncho-alveolar lavagevæsken (dvs. BAL), som prøver alveolar rum, lunge vaskulær perfusate (dvs. LVP), der prøver lungevakulturen og alveolar septal interstitium i tilfælde af en kompromitteret endotel barriere, venstre lunge cryosections, at se på hjemmehørende parenchymal og vedhængende leukocytter tilbage i lavaged lungevæv , perifert blod, som repræsenterer de cirkulerende leukocytter og bryst- og lårbenets knoglemarv, der prøver de proksimale og distale steder af henholdsvis hæmatopoietisk cellemobilisering under betændelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
De metoder, der præsenteres i den aktuelle undersøgelse fremhæve nytten af flere rum analyse til at studere flere cellulære begivenheder under lungebetændelse. Vi har sammenfattet resultaterne i tabel 2. Vi og mange laboratorier har grundigt studeret murine reaktion intranasal LPS instillation, som er præget af hurtig rekruttering af lunge neutrofiler, som topper mellem 6-24 timer efter hvilken opløsning spark i. Og for nylig har vi vist, at subklinisk O3 (ved 0,05 ppm i 2 timer) alene …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den gennemførte forskning er finansieret af præsidentens NSERC tilskud samt start-up midler fra Sylvia Fedoruk canadiske Center for Nuclear Innovation. Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation er finansieret af Innovation Saskatchewan. Fluorescens imaging blev udført på WCVM Imaging Centre, som er finansieret af NSERC. Jessica Brocos (MSc Student) og Manpreet Kaur (MSc Student) blev finansieret af start-up midler fra Sylvia Fedoruk canadiske Center for Nuklear Innovation.
Materials
| 33-plex Bioplex chemokine panel | Biorad | 12002231 | |
| 63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives | Leica | HCX PL APO CS (11506188) | |
| Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11045 | |
| Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11002 | |
| Alexa 488 conjugated phalloidin | Invitrogen | A12370 | |
| Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A | Millipore | 05-829X-555 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) | Invitrogen | A21112 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | |
| Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21070 | |
| Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa | BD Pharmingen | 553343 | |
| C57BL/6 J Mice | Jackson Laboratories | 64 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Leica TCS SP5 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | D1306 | aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C |
| Inverted fluorescent wide field microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Ketamine (Narketan) | Vetoquinol | 100 mg/ml | Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock |
| Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) | Invitrogen | 459240 | |
| Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) | Invitrogen | A-21351 | |
| Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) | Invitrogen | 16-5941-82 | |
| Pierce 660 nm protein assay | Thermoscientific | 22660 | |
| Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG | Abcam | ab2904 | |
| Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) | Invitrogen | 14-6093-81 | |
| Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) | Invitrogen | 16-9668-82 | |
| Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 53-5931-82 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) | BD Pharmingen | 553142 | |
| Reduced mitotracker orange | Invitrogen | M7511 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 20 mg/ml | Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock |
References
- Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).
- Aulakh, G. K. Neutrophils in the lung: “the first responders”. Cell Tissue Research. , (2017).
- Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).
- Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).
- Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).
- Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils. Cell Tissue Research. , (2013).
- Cakmak, S., et al. Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone. Environment International. 111, 200-211 (2018).
- Dauchet, L., et al. Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults. Environment International. 121, 610-619 (2018).
- Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).
- Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects. Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).
- Rush, B., et al. Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome. Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).
- Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States. Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).
- Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada. Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).
- Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone. Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).
- Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury. Physiological Reports. 8 (11), 14463 (2020).
- Aulakh, G. K., et al. Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging. Scientific Reports. 10 (1), 15699 (2020).
- Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, 24 (2008).
- Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
- Southam, D. S., Dolovich, M., O’Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).
- Aulakh, G. K. Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation. Cell Tissue Research. , (2020).
- Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
- Yipp, B. G., et al. The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection. Science Immunology. 2 (10), (2017).
- Lee, T. Y., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
- Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications. Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).
- Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). 생화학. 54 (33), 5185-5197 (2015).
- Oosting, R. S., et al. Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells. American Journal of Physiology. 262 (1), 63-68 (1992).
- Roth, S., et al. Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol. Cell Death & Discovery. 1, 15056 (2015).
- Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development. Cells. 8 (2), (2019).
- Gupta, A., et al. Extrapulmonary manifestations of COVID-19. Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).
- Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. . 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).
- Aulakh, G. K., et al. Multiple image x-radiography for functional lung imaging. Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009 (2018).
