Visualisation des adaptations cellulaires pulmonaires pendant les lésions pulmonaires aiguës murines induites par l’ozone et le LPS
Summary
Les souris exposées à l’ozone et à l’endotoxine bactérienne combinées montrent une mort cellulaire largement répandue, y compris celle des neutrophiles. Nous avons observé des adaptations cellulaires telles que la rupture du lamellipodia cytosquelettique, l’expression cellulaire accrue de la sous-unité complexe de synthase de V ATP β et l’angiostatin dans le lavage broncho-alvéolaire, la suppression de l’immuno-réaction de poumon et le recrutement retardé de neutrophile.
Abstract
Les poumons sont continuellement confrontés à des insultes directes et indirectes sous la forme de conditions inflammatoires stériles (particules ou toxines réactives) et infectieuses (bactériennes, virales ou fongiques). Une réponse écrasante de centre serveur peut avoir comme conséquence la respiration compromise et la lésion pulmonaire aiguë, qui est caractérisée par le recrutement de neutrophile de poumon en raison de la réponse patho-logique de retouche immunisée, coagulative et de tissu de centre serveur. Des méthodes microscopiques sensibles pour visualiser et quantifier les adaptations cellulaires pulmonaires murines, en réponse à une faible dose (0,05 ppm) d’ozone, un puissant polluant environnemental en combinaison avec le lipopolysaccharide bactérien, un agoniste TLR4, sont cruciales pour comprendre les mécanismes inflammatoires et de réparation de l’hôte. Nous décrivons une analyse microscopique fluorescente complète de divers compartiments de poumon et systémiques de corps, à savoir le fluide broncho-alvéolaire de lavage, le perfusat vasculaire de poumon, les cryosections gauches de poumon, et le perfusate sternal de moelle. Nous montrons des dommages des macrophages alvéolaires, des neutrophiles, du tissu parenchymal de poumon, aussi bien que des cellules de moelle en corrélation avec une réponse immunitaire retardée (jusqu’à 36-72 h) qui est marquée par des gradients discrets de chemokine dans les compartiments analysés. En outre, nous présentons la matrice extracellulaire de poumon et les interactions cytosquelettiques cellulaires (actine, tubuline), les espèces mitochondriques et réactives de l’oxygène, le plasminogen anti-coagulatif, son angiostatin anti-angiogénique de fragment de peptide, les sous-unités Mitochondriques de V de complexe de synthase d’ATP, α et β. Ces marqueurs de substitution, lorsqu’ils sont complétés par des essais cellulaires in vitro adéquats et des techniques d’imagerie animale in vivo telles que la microscopie intravitale, peuvent fournir des informations vitales vers la compréhension de la réponse pulmonaire à de nouveaux agents immunomodulateurs.
Introduction
La lésion pulmonaire aiguë (LAI) est une réponse pathologique cruciale des poumons aux stimuli infectieux ou autres stimuli nocifs qui est marquée par l’activation simultanée des systèmes immunitaires coagulatif, fibrinolytique et inné1. Les neutrophiles détectent rapidement les modèles de dommages microbiens et intracellulaires à travers la famille des récepteurs toll-like (TLR)2,3,4. Les neutrophiles libèrent des cytokines préformées et le contenu cytotoxique de granule, qui peuvent alors causer des dommages collatéraux de tissu. Les dommages alvéolaires qui s’ensuivent sont gâchés par la mort cellulaire secondaire conduisant à la libération de molécules telles que l’adénosine triphosphate (ATP)5, mettant ainsi dans un cercle vicieux d’immuno-dysrégulation.
Un problème non résolu dans la compréhension d’ALI se rapporte à la question de savoir comment les dommages sont initiés dans la membrane alvéolaire. Le complexe de transport d’électrons V, F1F0 ATP synthase, est une protéine mitochondriale connue pour être exprimée de manière omniprésente, sur la membrane plasmique cellulaire (y compris endothéliale, leucocytaire, épithéliale) pendant l’inflammation. Le cytosquelette cellulaire qui est composé d’actine et de tubuline, héberge de nombreuses formes cellulaires et fonction modulant ainsi que des protéines mitochondriales, respectivement. Nous avons récemment montré que le blocage de l’ATP synthase par une molécule endogène, l’angiostatine, réduit au silence le recrutement des neutrophiles, l’activation et le lipopolysaccharide (LPS) induit une inflammation pulmonaire6. Ainsi, les mécanismes biochimiques (SYNTHASE D’ATP) et immunisés (TLR4) pourraient régler la barrière alvéolaire pendant l’inflammation de poumon.
L’exposition à l’ozone (O3),un polluant environnemental, altère la fonction pulmonaire, augmente la susceptibilité aux infections pulmonaires, et de faibles niveaux d’exposition à L’O3 augmentent le risque de mortalité chez les personnes atteintes d’affections cardiorespiratoires sous-jacentes7,8,9,10,11,12,13,14. Ainsi, l’exposition à des concentrations physiologiquement pertinentes d’O3 fournit un modèle significatif d’ALI pour étudier les mécanismes fondamentaux de l’inflammation7,8. Notre laboratoire a récemment établi un modèle murin de faible doseO3 induite ALI15. Après avoir effectué une dose et une réponse temporelle à de faibles concentrationsd’O3, nous avons observé que l’exposition à 0,05 ppmO3 pendant 2 h, induit une lésion pulmonaire aiguë marquée par l’ATP synthase du poumon complexe V sous-unité β (ATPβ) et l’expression de l’angiostatine, similaire au modèle LPS. L’imagerie pulmonaire intravitale a révélé une désorganisation des microfilaments alvéolaires d’actine indiquant des lésions pulmonaires, et l’ablation des niveaux alvéolaires des espèces réactives septales de l’oxygène (ROS) (indiquant l’abrogation de la signalisation cellulaire de base) et du potentiel mitochondrique membranaire (indiquant une mort cellulaire aiguë) après une exposition de 2 h à 0,05 ppm O315 qui était corrélée avec un poumon hétérogène 18rétention FDG16,le recrutement des neutrophiles et la libération de cytokines, plus particulièrement IL-16 et SDF-1α. Le message à retenir de nos études récentes est que l’O3 produit une toxicité exponentiellement élevée lorsqu’il est exposé à des concentrations inférieures aux limites autorisées de 0,063 ppm sur 8 h (par jour) pour l’exposition humaine. Il est important de ne pas comprendre clairement si ces expositions subcliniques àO3 peuvent moduler les mécanismes médiés par TLR4 tels que l’endotoxine bactérienne17. Ainsi, nous avons étudié un modèle d’expositiono3 et LPS à double succès et avons observé les adaptations cellulaires immunitaires et non immunitaires.
Nous décrivons une analyse microscopique fluorescente complète de divers compartiments pulmonaires et systémiques du corps, à savoir le liquide de lavage broncho-alvéolaire (c.-à-d., BAL) qui échantillonne les espaces alvéolaires, le perfusat vasculaire pulmonaire (c.-à-d., LVP) qui échantillonne la vascularisation pulmonaire et l’interstitium septal alvéolaire en cas de barrière endothéliale compromise, cryosections pulmonaires gauches, pour examiner les leucocytes parenchymateux et adhérents résidents laissés dans le tissu pulmonaire lavage , le sang périphérique qui représente les leucocytes circulants et les perfusats sternaux et fémurs qui échantillonnent les sites proximaux et distaux de la mobilisation des cellules hématopoïétiques pendant l’inflammation, respectivement.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les méthodes présentées dans l’étude actuelle mettent en évidence l’utilité de l’analyse de compartiments multiples pour étudier des événements cellulaires multiples pendant l’inflammation de poumon. Nous avons résumé les constatations dans le tableau 2. Nous et beaucoup de laboratoires avons étudié intensivement la réponse murine à l’instillation intranasale de LPS, qui est marquée par le recrutement rapide des neutrophiles de poumon, qui culmine entre 6-24 h suivant quoi, la r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La recherche menée est financée par la subvention du président du CRSNG ainsi que par des fonds de démarrage du Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation. Le Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation est financé par Innovation Saskatchewan. L’imagerie par fluorescence a été réalisée au Centre d’imagerie WCVM, qui est financé par le CRSNG. Jessica Brocos (étudiante à la maîtrise) et Manpreet Kaur (étudiante à la maîtrise) ont été financées par les fonds de démarrage du Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation.
Materials
| 33-plex Bioplex chemokine panel | Biorad | 12002231 | |
| 63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives | Leica | HCX PL APO CS (11506188) | |
| Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11045 | |
| Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11002 | |
| Alexa 488 conjugated phalloidin | Invitrogen | A12370 | |
| Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A | Millipore | 05-829X-555 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) | Invitrogen | A21112 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | |
| Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21070 | |
| Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa | BD Pharmingen | 553343 | |
| C57BL/6 J Mice | Jackson Laboratories | 64 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Leica TCS SP5 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | D1306 | aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C |
| Inverted fluorescent wide field microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Ketamine (Narketan) | Vetoquinol | 100 mg/ml | Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock |
| Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) | Invitrogen | 459240 | |
| Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) | Invitrogen | A-21351 | |
| Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) | Invitrogen | 16-5941-82 | |
| Pierce 660 nm protein assay | Thermoscientific | 22660 | |
| Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG | Abcam | ab2904 | |
| Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) | Invitrogen | 14-6093-81 | |
| Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) | Invitrogen | 16-9668-82 | |
| Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 53-5931-82 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) | BD Pharmingen | 553142 | |
| Reduced mitotracker orange | Invitrogen | M7511 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 20 mg/ml | Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock |
References
- Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).
- Aulakh, G. K. Neutrophils in the lung: “the first responders”. Cell Tissue Research. , (2017).
- Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).
- Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).
- Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).
- Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils. Cell Tissue Research. , (2013).
- Cakmak, S., et al. Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone. Environment International. 111, 200-211 (2018).
- Dauchet, L., et al. Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults. Environment International. 121, 610-619 (2018).
- Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).
- Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects. Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).
- Rush, B., et al. Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome. Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).
- Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States. Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).
- Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada. Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).
- Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone. Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).
- Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury. Physiological Reports. 8 (11), 14463 (2020).
- Aulakh, G. K., et al. Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging. Scientific Reports. 10 (1), 15699 (2020).
- Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, 24 (2008).
- Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
- Southam, D. S., Dolovich, M., O’Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).
- Aulakh, G. K. Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation. Cell Tissue Research. , (2020).
- Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
- Yipp, B. G., et al. The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection. Science Immunology. 2 (10), (2017).
- Lee, T. Y., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
- Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications. Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).
- Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). 생화학. 54 (33), 5185-5197 (2015).
- Oosting, R. S., et al. Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells. American Journal of Physiology. 262 (1), 63-68 (1992).
- Roth, S., et al. Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol. Cell Death & Discovery. 1, 15056 (2015).
- Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development. Cells. 8 (2), (2019).
- Gupta, A., et al. Extrapulmonary manifestations of COVID-19. Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).
- Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. . 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).
- Aulakh, G. K., et al. Multiple image x-radiography for functional lung imaging. Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009 (2018).
