संयुक्त ओजोन और एलपीएस प्रेरित मुरीन तीव्र फेफड़ों की चोट के दौरान फेफड़ों के सेलुलर अनुकूलन की कल्पना
Summary
संयुक्त ओजोन और बैक्टीरियल एंडोटॉक्सिन उजागर चूहों को न्यूट्रोफिल सहित व्यापक प्रसार कोशिका मृत्यु दिखाई देती है। हमने सेलुलर अनुकूलन जैसे साइटोस्केलेटल लैमेलिपोडिया में व्यवधान, जटिल वी एटीपी सिंथास सबयूनिट β की सेलुलर अभिव्यक्ति और ब्रोनचो-अल्वेलर लावाज में एंजियोस्टैटिन, फेफड़ों की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का दमन और न्यूट्रोफिल भर्ती में देरी जैसे सेलुलर अनुकूलन देखा।
Abstract
फेफड़ों को लगातार बाँझ (कणों या प्रतिक्रियाशील विषाक्त पदार्थों) और संक्रामक (बैक्टीरियल, वायरल या फंगल) भड़काऊ स्थितियों के रूप में प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष अपमान का सामना करना पड़ता है। एक भारी मेजबान प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप श्वसन और तीव्र फेफड़ों की चोट हो सकती है, जो पाथो-तार्किक मेजबान प्रतिरक्षा, कोआ गुलाटीव और ऊतक रीमॉडलिंग प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप फेफड़ों के न्यूट्रोफिल भर्ती की विशेषता है। कम खुराक (0.05 पीपीएम) ओजोन, बैक्टीरियल लिपोपोलीसैकराइड, एक टीएलआर 4 एगोनिस्ट के संयोजन में एक शक्तिशाली पर्यावरण प्रदूषक, मेजबान भड़काऊ और मरम्मत तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं, कम खुराक (0.05 पीपीएम) ओजोन के जवाब में, मुरीन फेफड़ों के सेलुलर अनुकूलन की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए संवेदनशील सूक्ष्म तरीके महत्वपूर्ण हैं। हम विभिन्न फेफड़ों और प्रणालीगत शरीर के डिब्बों के एक व्यापक फ्लोरोसेंट सूक्ष्म विश्लेषण का वर्णन करते हैं, अर्थात् ब्रोन्चो-अल्वेलर लावेज तरल पदार्थ, फेफड़ों के संवहनी परफ्यूसेट, बाएं फेफड़ों के क्रायोस्क्यूक्शन, और स्टर्नल बोन मैरो परफ्यूसेट। हम अल्वोलार मैक्रोफेज, न्यूट्रोफिल, फेफड़ों के पैरेंचिमल ऊतक, साथ ही अस्थि मज्जा कोशिकाओं को देरी (36-72 घंटे तक) प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साथ संबंध में नुकसान दिखाते हैं जो विश्लेषण किए गए डिब्बों में असतत केमोकीन ग्रेडिएंट द्वारा चिह्नित होता है। इसके अलावा, हम फेफड़ों के एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स और सेलुलर साइटोस्केलेल इंटरैक्शन (ऐक्टिन, ट्यूबलिन), माइटोकॉन्ड्रियल और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां, एंटी-कोआ गुलाटिवेव प्लाज्मिनोजेन, इसका एंटी-एंजियोजेनिक पेप्टाइड टुकड़ा एंजियोस्टैटिन, माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी सिंथेस कॉम्प्लेक्स वी सबयूनिट, α और β पेश करते हैं। ये सरोगेट मार्कर, जब पर्याप्त इन विट्रो सेल-आधारित परख के साथ पूरक होते हैं और वीवो पशु इमेजिंग तकनीकों जैसे इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी में, उपन्यास इम्यूनोमोडुलेटरी एजेंटों के फेफड़ों की प्रतिक्रिया को समझने की दिशा में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं।
Introduction
तीव्र फेफड़ों की चोट (अली) संक्रामक या अन्य हानिकारक उत्तेजनाओं के लिए फेफड़ों की एक महत्वपूर्ण रोगात्मक प्रतिक्रिया है जो कोआ गुलाटीव, फाइब्रिनोलिटिक और जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली1के एक साथ सक्रियण द्वारा चिह्नित है। न्यूट्रोफिल टोल जैसे रिसेप्टर (टीएलआर) परिवार2, 3, 4के माध्यम से माइक्रोबियल के साथ-साथ इंट्रासेलुलर क्षति पैटर्न को तुरंतसमझतेहैं। न्यूट्रोफिल प्रीफॉर्म साइटोकिन्स और साइटोटॉक्सिक ग्रैन्यूल सामग्री जारी करते हैं, जो तब संपाश्र्वक ऊतक क्षति का कारण बन सकते हैं। आगामी अल्वोलार क्षति माध्यमिक कोशिका मृत्यु के साथ होती है जिससे एडेनोसाइन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) 5 जैसे अणुओं को रिहा कियाजाताहै, इस प्रकार प्रतिरक्षा-डिस्रेगुलेशन के दुष्चक्र में स्थापित होता है।
अली की समझ में एक अनसुलझी समस्या इस सवाल से संबंधित है कि अल्वेलर झिल्ली के भीतर चोट कैसे शुरू की जाती है। इलेक्ट्रॉन परिवहन परिसर वी, F1F0 एटीपी सिंथेस, एक माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन है जिसे सूजन के दौरान कोशिका (एंडोथेलियल, ल्यूकोसिट, एपिथेलियल सहित) प्लाज्मा झिल्ली पर सर्वव्यापी रूप से व्यक्त किया जाता है। सेल साइटोस्केलेटन जिसमें ऐक्टिन और ट्यूबलिन शामिल है, क्रमशः कई सेल आकार और कार्य मॉड्यूलिंग के साथ-साथ माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन को बंदरगाह करता है। हमने हाल ही में दिखाया है कि एक अंतर्जात अणु, एंजियोस्टैटिन, मौन न्यूट्रोफिल भर्ती, सक्रियण और लिपोपॉलिसाकराइड (एलपीएस) द्वारा एटीपी सिंथेस की नाकाबंदी फेफड़ों की सूजन6प्रेरित । इस प्रकार, दोनों जैव रासायनिक (एटीपी सिंथेस) और प्रतिरक्षा (TLR4) तंत्र फेफड़ों की सूजन के दौरान अल्वियोलर बाधा को विनियमित कर सकते हैं ।
ओजोन (ओ3),एक पर्यावरण प्रदूषक, फेफड़ों के कार्य को ख़राब करता है, फेफड़े के संक्रमण के प्रति संवेदनशीलता बढ़ाता है, और ओ3 एक्सपोजर के छोटे निम्न स्तर अंतर्निहित कार्डियोरेस्पिरेटरी स्थितियों7,8,9,10, 11,12, 13,14के साथ उन लोगों में मृत्यु के जोखिम को बढ़ाते हैं। इस प्रकार , ओ3 की शारीरिक रूप से प्रासंगिक सांद्रता के संपर्क में आने से सूजन के मौलिक तंत्रों का अध्ययन करने के लिए अली का एक सार्थक मॉडल प्रदान करता है7,8. हमारी प्रयोगशाला ने हाल ही में कम खुराक ओ3 प्रेरित अली15का एक मुरीन मॉडल स्थापित किया है । कम ओ 3 सांद्रता के लिए एक खुराक और समय-प्रतिक्रिया करने के बाद, हमनेदेखा कि 2 घंटे के लिए 0.05 पीपीएम ओ3 के संपर्क में, फेफड़ों की तीव्र चोट को प्रेरित करता है जो फेफड़ों के एटीपी सिंथेस कॉम्प्लेक्स वी सबयूनिट β (एटीपी) और एंजियोस्टैटिन अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित है, एलपीएस मॉडल के समान। इंट्राविटल फेफड़ों इमेजिंग से फेफड़ों के नुकसान का संकेत देने वाले अल्वेलर ऐक्टिन माइक्रोफिलामेंट्स के विघटन का पता चला, और अल्वेलर सेप्टल प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के स्तर (बेसलाइन सेल सिग्नलिंग के उन्मूलन का संकेत) और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (तीव्र कोशिका मृत्यु का संकेत) 0.05 पीपीएम ओ3 15के 2 एच एक्सपोजर के बाद जो विषम फेफड़े18 एफडीजी रिटेंशन16,न्यूट्रोफिल भर्ती और साइकोकिन रिलीज के साथ सहसंबद्ध है। सबसे विशेष रूप से आईएल-16 और एसडीएफ-1α। हमारे हाल के अध्ययनों से ले घर संदेश यह है कि ओ3 तेजी से उच्च विषाक्तता पैदा करता है जब मानव जोखिम के लिए 8 घंटे (प्रति दिन) से अधिक ०.०६३ पीपीएम की अनुमति सीमा से नीचे सांद्रता पर उजागर । महत्वपूर्ण बात यह है कि इस बारे में कोई स्पष्ट समझ मौजूद नहीं है कि क्या ये उप-नैदानिक ओ3 एक्सपोजर टीएलआर 4-मध्यस्थता तंत्र को मिलाना कर सकते हैं जैसे बैक्टीरियल एंडोटॉक्सिन17द्वारा। इस प्रकार, हमने दोहरी-हिट ओ3 और एलपीएस एक्सपोजर मॉडल का अध्ययन किया और प्रतिरक्षा और गैर-प्रतिरक्षा सेलुलर अनुकूलन देखा।
हम विभिन्न फेफड़ों और प्रणालीगत शरीर के डिब्बों के एक व्यापक फ्लोरोसेंट सूक्ष्म विश्लेषण का वर्णन करते हैं, अर्थात् ब्रोनचो-अल्वेलर लावेज तरल पदार्थ (यानी, बाल) जो अल्वोलार रिक्त स्थान, फेफड़ों के संवहनी परफ्यूसेट (यानी, एलवीपी) के नमूने लेते हैं जो एक समझौता एंडोथेलियल बैरियर की स्थिति में पल्मोनरी वैक्यूलेचर और अल्वेलर सेप्टल इंटरस्टिटियम का नमूने लेते हैं, फेफड़ों के क्रायोसेक्शन छोड़ दिया जाता है, जो लावग्ड फेफड़ों के ऊतकों में छोड़ दिया निवासी पैरान्चिमल और अनुयायी ल्यूकोसाइट्स को देखने के लिए , परिधीय रक्त जो परिसंचारी ल्यूकोसाइट्स और स्टर्नल और फीमर बोन मैरो का प्रतिनिधित्व करता है जो सूजन के दौरान हेमेटोपोइटिक सेल जुटाने के समीपस्थ और डिस्टल साइटों का नमूना लेता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान अध्ययन में प्रस्तुत तरीकों फेफड़ों की सूजन के दौरान कई सेलुलर घटनाओं का अध्ययन करने के लिए कई डिब्बे विश्लेषण की उपयोगिता पर प्रकाश डाला । हमने तालिका 2में निष्कर्षों का सारांश दिया है ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
किए गए शोध को राष्ट्रपति के NSERC अनुदान के साथ-साथ सिल्विया फेडोरुक कनाडाई सेंटर फॉर न्यूक्लियर इनोवेशन से स्टार्ट-अप फंड द्वारा वित्त पोषित किया जाता है । सिल्विया फेडोरुक कनाडाई सेंटर फॉर न्यूक्लियर इनोवेशन को इनोवेशन साकटचेवान द्वारा वित्त पोषित किया जाता है । फ्लोरेसेंस इमेजिंग WCVM इमेजिंग सेंटर में किया गया था, जो NSERC द्वारा वित्त पोषित है । जेसिका ब्रोकोस (एमएससी स्टूडेंट) और मनप्रीत कौर (एमएससी स्टूडेंट) को सिल्विया फेडोरुक कैनेडियन सेंटर फॉर न्यूक्लियर इनोवेशन से स्टार्ट-अप फंड्स द्वारा फंड दिया गया ।
Materials
| 33-plex Bioplex chemokine panel | Biorad | 12002231 | |
| 63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives | Leica | HCX PL APO CS (11506188) | |
| Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11045 | |
| Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11002 | |
| Alexa 488 conjugated phalloidin | Invitrogen | A12370 | |
| Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A | Millipore | 05-829X-555 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) | Invitrogen | A21112 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | |
| Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21070 | |
| Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa | BD Pharmingen | 553343 | |
| C57BL/6 J Mice | Jackson Laboratories | 64 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Leica TCS SP5 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | D1306 | aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C |
| Inverted fluorescent wide field microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Ketamine (Narketan) | Vetoquinol | 100 mg/ml | Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock |
| Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) | Invitrogen | 459240 | |
| Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) | Invitrogen | A-21351 | |
| Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) | Invitrogen | 16-5941-82 | |
| Pierce 660 nm protein assay | Thermoscientific | 22660 | |
| Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG | Abcam | ab2904 | |
| Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) | Invitrogen | 14-6093-81 | |
| Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) | Invitrogen | 16-9668-82 | |
| Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 53-5931-82 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) | BD Pharmingen | 553142 | |
| Reduced mitotracker orange | Invitrogen | M7511 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 20 mg/ml | Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock |
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