Visualizzazione degli adattamenti cellulari polmonari durante l'ozono combinato e la lesione polmonare acuta murina indotta da LPS
Summary
L’ozono combinato e i topi esposti all’endotossina batterica mostrano una morte cellulare diffusa, compresa quella dei neutrofili. Abbiamo osservato adattamenti cellulari come l’interruzione della lamellipodia citoscheletricha, l’aumento dell’espressione cellulare della complessa subunità V ATP sintasi β e l’angiostatina nella lavanda bronco-alveolare, la soppressione della risposta immunitaria polmonare e il reclutamento ritardato di neutrofili.
Abstract
I polmoni si trovano continuamente di fronte a insulti diretti e indiretti sotto forma di condizioni infiammatorie sterili (particelle o tossine reattive) e infettive (batteriche, virali o fungine). Una risposta ospite travolgente può comportare respirazione compromessa e lesioni polmonari acute, che è caratterizzata dal reclutamento di neutrofili polmonari a seguito della risposta immunitaria, coagulativa e rimodellante dei tessuti dell’ospite pato-logico. Metodi microscopici sensibili per visualizzare e quantificare gli adattamenti cellulari polmonari murini, in risposta all’ozono a basse dosi (0,05 ppm), un potente inquinante ambientale in combinazione con lipopolysaccharide batterico, un agonista TLR4, sono cruciali per comprendere i meccanismi infiammatori e riparatori dell’ospite. Descriviamo un’analisi microscopica fluorescente completa di vari compartimenti polmonari e sistemici del corpo, vale a dire il liquido di lavanda bronco-alveolare, il perfusato vascolare polmonare, le criosezioni polmonari sinistra e il perfusato di midollo osseo sternale. Mostriamo danni di macrofagi alveolari, neutrofili, tessuto parenchimico polmonare, così come cellule del midollo osseo in correlazione con una risposta immunitaria ritardata (fino a 36-72 ore) che è contrassegnata da gradienti discreti di chemiochina nei compartimenti analizzati. Inoltre, presentiamo la matrice extracellulare polmonare e le interazioni citoscheletriche cellulari (actina, tubulina), specie di ossigeno mitocondriale e reattivo, plasminogeno antico coagulativo, angiostatina del frammento peptidico anti-angiogenico, subunità V complesso mitocondriale di ATP sintasi, α e β. Questi marcatori surrogati, se integrati con adeguati saggi a base cellulare in vitro e tecniche di imaging animale in vivo come la microscopia intravitale, possono fornire informazioni vitali per comprendere la risposta polmonare a nuovi agenti immunomodulatori.
Introduction
La lesione polmonare acuta (ALI) è una risposta patologica cruciale dei polmoni a stimoli infettivi o altri stimoli dannosi che è contrassegnata dall’attivazione simultanea di sistemi immunitari coagulativi, fibrinolitici e innati1. I neutrofili percepisce prontamente modelli di danni microbici e intracellulari attraverso la famiglia di recettori simili a pedaggio (TLR)2,3,4. I neutrofili rilasciano citochine preformate e contenuti di granuli citotossici, che possono quindi causare danni collaterali ai tessuti. Il conseguente danno alveolare è rovinato dalla morte cellulare secondaria che porta al rilascio di molecole come il trifosfato di adenosina (ATP)5, stabilendo così in un circolo vizioso di disregolazione immunitaria.
Un problema irrisolto nella comprensione dell’ALI si riferisce alla questione di come la lesione sia iniziata all’interno della membrana alveolare. Il complesso di trasporto elettronico V, F1F0 ATP sintasi, è una proteina mitocondriale nota per essere espressa onnipresentemente, sulla membrana plasmatica cellulare (inclusa endoteliale, leucocita, epiteliale) durante l’infiammazione. Il citoscheletro cellulare, composto da actina e tubulina, ospita rispettivamente molte forme cellulari e funzioni modulanti, nonché proteine mitocondriali. Abbiamo recentemente dimostrato che il blocco dell’ATP sintasi da parte di una molecola endogena, angiostatina, silenzia il reclutamento neutrofilo, l’attivazione e l’infiammazione polmonare indotta dal lipopolysaccharide (LPS)6. Pertanto, sia i meccanismi biochimici (ATP sintasi) che immunitari (TLR4) potrebbero regolare la barriera alveolare durante l’infiammazione polmonare.
L’esposizione all’ozono (O3),un inquinante ambientale, compromette la funzione polmonare, aumenta la suscettibilità alle infezioni polmonari e brevi bassi livelli di esposizioni O3 aumentano il rischio di mortalità in quelli con condizioni cardiorespiratorie sottostanti7,8,9,10,11,12,13,14. Pertanto, l’esposizione a concentrazioni fisiologicamente rilevanti di O3 fornisce un modello significativo di ALI per studiare i meccanismi fondamentali dell’infiammazione7,8. Il nostro laboratorio ha recentemente stabilito un modello murino di ALI15indotto da O3 a basso consumo. Dopo aver eseguito una dose e una risposta nel tempo a basse concentrazioni di O3, abbiamo osservato che l’esposizione a 0,05 ppm O3 per 2 ore, induce una lesione polmonare acuta che è contrassegnata dalla subunità V complessa di ATP sintasi polmonare β (ATPβ) e dall’espressione di angiostatina, simile al modello LPS. L’imaging polmonare intravitale ha rivelato la disorganizzazione dei microfilamenti di actina alveolare che indicano danni polmonari, e l’ablazione dei livelli di ossigeno reattivo del setto alveolare (ROS) (che indica l’abrogazione della segnalazione cellulare basale) e del potenziale della membrana mitocondriale (che indica la morte acuta delle cellule) dopo 2 h di esposizione a 0,05 ppm O315 che era correlato con un polmone eterogeneo 18ritenzione di FDG16, reclutamento neutrofilo e rilascio di citochine, in particolare IL-16 e SDF-1α. Il messaggio da portare a casa dai nostri recenti studi è che O 3 produce tossicità esponenzialmenteelevata se esposto a concentrazioni inferiori ai limiti consentiti di 0,063 ppm su 8 h (al giorno) per l’esposizione umana. È importante sottolineare che non esiste una chiara comprensione se queste esposizioni subclinica O3 possano modulare meccanismi mediati da TLR4 come l’endotossinabatterica 17. Pertanto, abbiamo studiato un modello di esposizione O3 e LPS a doppio colpo e abbiamo osservato gli adattamenti cellulari immunitari e non immuni.
Descriviamo un’analisi microscopica fluorescente completa di vari compartimenti polmonari e sistemici del corpo, vale a dire il liquido di lavanda bronco-alveolare (cioè, BAL) che campiona gli spazi alveolari, il perfusato vascolare polmonare (cioè l’LVP) che campiona la vascolarizzazione polmonare e l’interstizio settale alveolare in caso di barriera endoteliale compromessa, criosezioni polmonari sinistra, per esaminare i leucociti parenchimici e aderenti residenti lasciati nel tessuto polmonare lavato , sangue periferico che rappresenta i leucociti circolanti e i perfusati del midollo osseo sternale e femore che campionano rispettivamente i siti prossimali e distale della mobilitazione cellulare ematopoietica durante l’infiammazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi presentati nello studio attuale evidenziano l’utilità dell’analisi a compartimento multiplo per studiare più eventi cellulari durante l’infiammazione polmonare. Abbiamo riassunto i risultati della tabella 2. Noi e molti laboratori abbiamo studiato ampiamente la risposta murina all’instillazione intranasale LPS, che è segnata dal rapido reclutamento di neutrofili polmonari, che raggiunge picchi tra 6-24 ore dopo di che, la risoluzione prende il via. E recentemente, abbiamo dimostrato che il su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca condotta è finanziata dalla sovvenzione NSERC del Presidente e dai fondi di start-up del Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation. Il Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation è finanziato da Innovation Saskatchewan. L’imaging a fluorescenza è stato eseguito presso il WCVM Imaging Centre, finanziato da NSERC. Jessica Brocos (MSc Student) e Manpreet Kaur (studentessa di laurea magistro) sono state finanziate dai fondi di start-up del Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation.
Materials
| 33-plex Bioplex chemokine panel | Biorad | 12002231 | |
| 63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives | Leica | HCX PL APO CS (11506188) | |
| Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11045 | |
| Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11002 | |
| Alexa 488 conjugated phalloidin | Invitrogen | A12370 | |
| Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A | Millipore | 05-829X-555 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) | Invitrogen | A21112 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | |
| Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21070 | |
| Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa | BD Pharmingen | 553343 | |
| C57BL/6 J Mice | Jackson Laboratories | 64 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Leica TCS SP5 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | D1306 | aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C |
| Inverted fluorescent wide field microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Ketamine (Narketan) | Vetoquinol | 100 mg/ml | Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock |
| Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) | Invitrogen | 459240 | |
| Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) | Invitrogen | A-21351 | |
| Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) | Invitrogen | 16-5941-82 | |
| Pierce 660 nm protein assay | Thermoscientific | 22660 | |
| Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG | Abcam | ab2904 | |
| Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) | Invitrogen | 14-6093-81 | |
| Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) | Invitrogen | 16-9668-82 | |
| Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 53-5931-82 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) | BD Pharmingen | 553142 | |
| Reduced mitotracker orange | Invitrogen | M7511 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 20 mg/ml | Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock |
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