Visualisering av lungecelletilpasninger under kombinert ozon og LPS indusert Murine akutt lungeskade
Summary
Kombinert ozon og bakteriell endotoksin eksponert mus viser bred spredt celledød, inkludert nøytrofiler. Vi observerte cellulære tilpasninger som forstyrrelse av cytoskeletal lamellipodia, økt cellulært uttrykk for kompleks V ATP syntase subenhet β og angiostatin i bronko-alveolar lavage, undertrykkelse av lunge immunrespons og forsinket nøytrofil rekruttering.
Abstract
Lunger står kontinuerlig overfor direkte og indirekte fornærmelser i form av sterile (partikler eller reaktive giftstoffer) og smittsomme (bakterielle, virale eller sopp) inflammatoriske forhold. En overveldende vertsrespons kan føre til kompromittert respirasjon og akutt lungeskade, som er preget av lunge nøytrofil rekruttering som følge av den pato-logiske verten immun, koagulativ og vev ombygging respons. Sensitive mikroskopiske metoder for å visualisere og kvantifisere murin lunge cellulære tilpasninger, som svar på lavdose (0,05 ppm) ozon, en potent miljøgift i kombinasjon med bakteriell lipopolysakkarid, en TLR4-agonist, er avgjørende for å forstå vertsinflammatoriske og reparasjonsmekanismer. Vi beskriver en omfattende fluorescerende mikroskopisk analyse av ulike lunge- og systemiske kroppsrom, nemlig bronko-alveolar lavagevæske, lungevaskulær perfusat, venstre lungekryosser og sternal benmarg perfusat. Vi viser skade på alveolar makrofager, nøytrofiler, lungeparenchymalt vev, samt benmargsceller i korrelasjon med en forsinket (opptil 36-72 h) immunrespons som er preget av diskrete kjemokingradienter i de analyserte rommene. I tillegg presenterer vi lunge ekstracellulær matrise og cellulære cytoskeletale interaksjoner (aktin, tubulin), mitokondrie og reaktive oksygenarter, antikoagulerende plasminogen, dets anti-angiogene peptidfragment angiostatin, mitokondrie-ATP-syntasekomplekset V-underenheter, α og β. Disse surrogatmarkørene, når de suppleres med tilstrekkelig in vitro cellebaserte analyser og in vivo dyreavbildningsteknikker som intravital mikroskopi, kan gi viktig informasjon for å forstå lungeresponsen på nye immunmodulerende midler.
Introduction
Akutt lungeskade (ALI) er en avgjørende patologisk respons av lunger til smittsomme eller andre skadelige stimuli som er preget av samtidig aktivering av koagulativ, fibrinolytisk og medfødt immunforsvar1. Nøytrofiler registrerer raskt mikrobielle så vel som intracellulære skademønstre gjennom den tolllignende reseptorfamilien (TLR)2,3,4. Nøytrofiler frigjør preformede cytokiner og cytotoksisk granulatinnhold, noe som deretter kan forårsake sikkerhetsskade. Den påfølgende alveolarskaden er marred med sekundær celledød som fører til frigjøring av molekyler som adenosin triphosfat (ATP)5, og dermed satt i en ond syklus av immundysregulering.
Et uløst problem i forståelsen av ALI er knyttet til spørsmålet om hvordan skaden er initiert i alveolarmembranen. Elektrontransportkomplekset V, F1F0 ATP-syntase, er et mitokondrieprotein kjent for å uttrykkes allestedsnærværende, på celle (inkludert endotelial, leukocytt, epitel) plasmamembran under betennelse. Cellesytoskjelettet som består av aktin og tubulin, har mange celleformer og funksjon som modulerer henholdsvis mitokondrieproteiner. Vi har nylig vist at blokade av ATP-syntase av et endogent molekyl, angiostatin, stillhet nøytrofil rekruttering, aktivering og lipopolysakkarid (LPS) indusert lungebetennelse6. Dermed kan både biokjemiske (ATP syntase) og immunmekanismer (TLR4) regulere alveolarbarrieren under lungebetennelse.
Eksponering for ozon (O3), en miljøgift, svekker lungefunksjonen, øker følsomheten for lungeinfeksjoner, og korte lave nivåer av O3-eksponeringer øker risikoen for dødelighet hos de med underliggende kardiorespiratoriske forhold7,8,9,10,11,12,13,14. Dermed gir eksponering for fysiologisk relevante konsentrasjoner av O3 en meningsfull modell av ALI for å studere grunnleggende mekanismer for betennelse7,8. Laboratoriet vårt har nylig etablert en murinmodell av lavdose O3 indusert ALI15. Etter å ha utført en dose og tidsrespons på lave O3-konsentrasjoner, observerte vi at eksponering for 0,05 ppm O3 i 2 timer, induserer akutt lungeskade som er preget av lunge ATP syntase kompleks V-underenhet β (ATPβ) og angiostatinuttrykk, lik LPS-modellen. Intravital lungeavbildning avdekket uorganisering av alveolar actinmikrofilamenter som indikerer lungeskade, og ablasjon av alveolar septal reaktive oksygenarter (ROS) nivåer (indikerer abrogasjon av baseline celle signalering) og mitokondriemembran potensial (indikerer akutt celledød) etter 2 h eksponering for 0,05 ppm O315 som korrelert med en heterogen lunge 18FDG oppbevaring16, nøytrofil rekruttering og cytokinfrigjøring, spesielt IL-16 og SDF-1α. Take-home-meldingen fra våre nylige studier er at O3 produserer eksponentielt høy toksisitet når den eksponeres ved konsentrasjoner under de tillatte grensene på 0,063 ppm over 8 timer (per dag) for menneskelig eksponering. Det er viktig at det ikke finnes noen klar forståelse av om disse subkliniske O3-eksponeringene kan modulere TLR4-medierte mekanismer som ved bakteriell endotoksin17. Dermed studerte vi en dual-hit O3 og LPS eksponeringsmodell og observerte immun- og ikke-immuncelletilpasninger.
Vi beskriver en omfattende fluorescerende mikroskopisk analyse av ulike lunge- og systemiske kroppsrom, nemlig bronko-alveolar lavagevæske (dvs. BAL) som prøver alveolarrommene, lungevaskulært perfusat (dvs. LVP) som prøver lungevaskulaturen og alveolaren septal interstitium i tilfelle en kompromittert endotelbarriere, venstre lungekrysoseksjoner, for å se på beboere parenchymale og tilhørende leukocytter igjen i lavaged lungevev , perifert blod som representerer de sirkulerende leukocyttene og sternal- og lårbenmargen perfusater som prøver de proksimale og distale stedene for hematopoietisk cellemobilisering under betennelse, henholdsvis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metodene som presenteres i den nåværende studien fremhever nytten av multippel romanalyse for å studere flere cellulære hendelser under lungebetennelse. Vi har oppsummert funnene i tabell 2. Vi og mange laboratorier har i stor grad studert murinresponsen på intranasal LPS-instillasjon, som er preget av rask rekruttering av lungenøytrofiler, som topper mellom 6-24 timer, oppløsning sparker inn. Og nylig har vi vist at sub-klinisk O3 (ved 0,05 ppm i 2 timer) alene kan indusere betydelig l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen som utføres er finansiert av presidentens NSERC-tilskudd samt oppstartsmidler fra Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation. Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation er finansiert av Innovation Saskatchewan. Fluorescensavbildning ble utført ved WCVM Imaging Centre, som er finansiert av NSERC. Jessica Brocos (MSc Student) og Manpreet Kaur (MSc Student) ble finansiert av oppstartsfondene fra Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation.
Materials
| 33-plex Bioplex chemokine panel | Biorad | 12002231 | |
| 63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives | Leica | HCX PL APO CS (11506188) | |
| Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11045 | |
| Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11002 | |
| Alexa 488 conjugated phalloidin | Invitrogen | A12370 | |
| Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A | Millipore | 05-829X-555 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) | Invitrogen | A21112 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | |
| Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21070 | |
| Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa | BD Pharmingen | 553343 | |
| C57BL/6 J Mice | Jackson Laboratories | 64 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Leica TCS SP5 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | D1306 | aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C |
| Inverted fluorescent wide field microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Ketamine (Narketan) | Vetoquinol | 100 mg/ml | Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock |
| Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) | Invitrogen | 459240 | |
| Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) | Invitrogen | A-21351 | |
| Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) | Invitrogen | 16-5941-82 | |
| Pierce 660 nm protein assay | Thermoscientific | 22660 | |
| Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG | Abcam | ab2904 | |
| Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) | Invitrogen | 14-6093-81 | |
| Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) | Invitrogen | 16-9668-82 | |
| Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 53-5931-82 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) | BD Pharmingen | 553142 | |
| Reduced mitotracker orange | Invitrogen | M7511 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 20 mg/ml | Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock |
References
- Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).
- Aulakh, G. K. Neutrophils in the lung: “the first responders”. Cell Tissue Research. , (2017).
- Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).
- Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).
- Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).
- Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils. Cell Tissue Research. , (2013).
- Cakmak, S., et al. Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone. Environment International. 111, 200-211 (2018).
- Dauchet, L., et al. Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults. Environment International. 121, 610-619 (2018).
- Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).
- Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects. Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).
- Rush, B., et al. Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome. Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).
- Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States. Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).
- Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada. Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).
- Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone. Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).
- Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury. Physiological Reports. 8 (11), 14463 (2020).
- Aulakh, G. K., et al. Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging. Scientific Reports. 10 (1), 15699 (2020).
- Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, 24 (2008).
- Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
- Southam, D. S., Dolovich, M., O’Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).
- Aulakh, G. K. Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation. Cell Tissue Research. , (2020).
- Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
- Yipp, B. G., et al. The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection. Science Immunology. 2 (10), (2017).
- Lee, T. Y., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
- Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications. Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).
- Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). 생화학. 54 (33), 5185-5197 (2015).
- Oosting, R. S., et al. Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells. American Journal of Physiology. 262 (1), 63-68 (1992).
- Roth, S., et al. Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol. Cell Death & Discovery. 1, 15056 (2015).
- Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development. Cells. 8 (2), (2019).
- Gupta, A., et al. Extrapulmonary manifestations of COVID-19. Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).
- Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. . 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).
- Aulakh, G. K., et al. Multiple image x-radiography for functional lung imaging. Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009 (2018).
