Visualización De Las Adaptaciones Celulares Pulmonares Durante La Lesión Pulmonar Aguda Murina Inducida Por Ozono Combinado Y LPS
Summary
Los ratones expuestos al ozono combinado y a las endotoxinas bacterianas muestran una muerte celular muy extendida, incluida la de los neutrófilos. Observamos adaptaciones celulares tales como interrupción del lamellipodia citoesquelético, expresión celular creciente de la subunidad compleja del synthase del ATP de V β y angiostatin en lavado bronco-alveolar, supresión de la inmunorespuesta del pulmón y reclutamiento retrasado del neutrófilo.
Abstract
Los pulmones se enfrentan continuamente a insultos directos e indirectos en forma de condiciones inflamatorias estériles (partículas o toxinas reactivas) e infecciosas (bacterianas, virales o fúngicas). Una respuesta abrumadora del anfitrión puede dar lugar a la respiración comprometida y a lesión de pulmón aguda, que es caracterizada por el reclutamiento del neutrófilo del pulmón como resultado de la respuesta de remodelación inmune, coagulativa y del tejido pato-lógica del anfitrión. Los métodos microscópicos sensibles para visualizar y cuantificar las adaptaciones celulares pulmonares murinas, en respuesta al ozono de dosis bajas (0,05 ppm), un potente contaminante ambiental en combinación con lipopolisacárido bacteriano, un agonista TLR4, son cruciales para comprender los mecanismos inflamatorios y de reparación del huésped. Describimos un análisis microscópico fluorescente comprensivo del vario pulmón y de los compartimientos sistémicos del cuerpo, a saber el líquido de lavado bronco-alveolar, el perfusate vascular del pulmón, los cryosections izquierdos del pulmón, y el perfusate esternal de la médula. Mostramos daño de macrófagos alveolares, neutrófilos, tejido parenquimatoso pulmonar, así como células de médula ósea en correlación con una respuesta inmune retrasada (hasta 36-72 h) que se caracteriza por gradientes discretos de quimioquinas en los compartimentos analizados. Además, presentamos la matriz extracelular pulmonar y las interacciones citoesqueléticos celulares (actina, tubulina), especies de oxígeno mitocondrial y reactivo, plasminógeno anticoagulante, su fragmento peptídico antiangiogénico angiostatina, las subunidades mitocondriales del complejo V atp sintasa, α y β. Estos marcadores sustitutos, cuando están complementados con análisis célula-basados ines vitro adecuados y técnicas de proyección de imagen animales in vivo tales como microscopia intravital, pueden proporcionar la información vital hacia la comprensión de la respuesta del pulmón a los agentes inmunomoduladores nuevos.
Introduction
La lesión pulmonar aguda (LPA) es una respuesta patológica crucial de los pulmones a estímulos infecciosos u otros estímulos dañinos que se caracteriza por la activación simultánea de los sistemas inmunitario coagulativo, fibrinolítico e innato1. Los neutrófilos detectan rápidamente patrones de daño microbiano e intracelular a través de la familia de receptores toll-like (TLR)2,3,4. Los neutrófilos liberan citoquinas preformadas y contenido de gránulos citotóxicos, que luego pueden causar daño tisular colateral. El daño alveolar subsiguiente se empaña con la muerte celular secundaria que lleva al lanzamiento de moléculas tales como trifosfato de adenosina (ATP)5,así fijando en un círculo vicioso del inmune-dysregulation.
Un problema sin resolver en la comprensión de ALI se relaciona con la cuestión de cómo se inicia la lesión dentro de la membrana alveolar. El complejo de transporte de electrones V, F1F0 ATP sintasa, es una proteína mitocondrial conocida por expresarse ubicuamente, en la membrana plasmática celular (incluyendo endotelial, leucocito, epitelial) durante la inflamación. El citoesqueleto celular que se compone de actina y tubulina, alberga muchas formas celulares y modulación de la función, así como proteínas mitocondriales, respectivamente. Recientemente hemos demostrado que el bloqueo de la ATP sintasa por una molécula endógena, angiostatina, silencia el reclutamiento de neutrófilos, la activación y el lipopolisacárido (LPS) indujo la inflamación pulmonar6. Así, los mecanismos bioquímicos (synthase del ATP) e inmunes (TLR4) pudieron regular la barrera alveolar durante la inflamación del pulmón.
La exposición al ozono (O3),un contaminante ambiental, deteriora la función pulmonar, aumenta la susceptibilidad a las infecciones pulmonares, y los niveles bajos cortos de exposiciones a O3 aumentan el riesgo de mortalidad en aquellos con afecciones cardiorrespiratorias subyacentes7,8,9,10,11,12,13,14. Así, la exposición a concentraciones fisiológicamente relevantes deO3 proporciona un modelo significativo de ALÍ para estudiar los mecanismos fundamentales de la inflamación7,8. Nuestro laboratorio ha establecido recientemente un modelo murino de dosis bajas de O3 inducida por ALI15. Después de realizar una dosis y tiempo-respuesta a bajas concentraciones deO3, observamos que la exposición a 0,05 ppmO3 durante 2 h, induce una lesión pulmonar aguda que está marcada por la subunidad de la subunidad β del complejo V de ATP sintasa pulmonar (ATPβ) y la expresión de angiostatina, similar al modelo LPS. Las imágenes pulmonares intravitales revelaron desorganización de los microfilamentos de actina alveolar que indican daño pulmonar, y la ablación de los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) septal alveolares (que indican la abrogación de la señalización celular basal) y el potencial de membrana mitocondrial (que indica muerte celular aguda) después de la exposición de 2 h a 0,05 ppm O315 que se correlacionaron con un pulmón heterogéneo 18Retención de FDG16,reclutamiento de neutrófilos y liberación de citoquinas, sobre todo IL-16 y SDF-1α. El mensaje para llevar a casa de nuestros estudios recientes es que O3 produce una toxicidad exponencialmente alta cuando se expone a concentraciones por debajo de los límites permitidos de 0,063 ppm durante 8 h (por día) para la exposición humana. Es importante destacar que no existe una comprensión clara sobre si estas exposiciones subclínicas a O3 pueden modular mecanismos mediados por TLR4, como por la endotoxina bacteriana17. Por lo tanto, se estudió un doble golpe O3 y lps modelo de exposición y observó las adaptaciones celulares inmunes y no inmunes.
Describimos un análisis microscópico fluorescente comprensivo de varios compartimientos del pulmón y del cuerpo sistémico, a saber el líquido de lavado bronco-alveolar (es decir, BAL) que muestrea los espacios alveolares, el perfusate vascular del pulmón (es decir, LVP) que muestrea la vasculatura pulmonar y el intersticio septal alveolar en caso de una barrera endotelial comprometida, criosecciones izquierdas del pulmón, para mirar en los leucocitos parenquimales y adherentes residentes dejados en el tejido pulmonar lavado , sangre periférica que representa los leucocitos circulantes y los perfundsatos de médula ósea esternal y fémur que muestrean los sitios proximales y distales de movilización de células hematopoyéticas durante la inflamación, respectivamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos presentados en el estudio actual destacan la utilidad del análisis del compartimiento múltiple para estudiar eventos celulares múltiples durante la inflamación del pulmón. Hemos resumido los resultados en el Cuadro 2. Nosotros y muchos laboratorios hemos estudiado extensivamente la respuesta murine a la instilación intranasal de los LPS, que es marcada por el reclutamiento rápido de neutrófilos del pulmón, que alcanza un máximo entre 6-24 h después de los cuales, la resolución pa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación realizada está financiada por la subvención del Presidente NSERC, así como con fondos 19 del Centro Canadiense para la Innovación Nuclear Sylvia Fedoruk. El Centro Canadiense de Innovación Nuclear Sylvia Fedoruk está financiado por Innovation Saskatchewan. Las imágenes de fluorescencia se realizaron en el Centro de Imágenes WCVM, que es financiado por NSERC. Jessica Brocos (estudiante de maestría) y Manpreet Kaur (estudiante de maestría) fueron financiadas por los fondos de puesta en marcha del Centro Canadiense de Innovación Nuclear Sylvia Fedoruk.
Materials
| 33-plex Bioplex chemokine panel | Biorad | 12002231 | |
| 63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives | Leica | HCX PL APO CS (11506188) | |
| Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11045 | |
| Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11002 | |
| Alexa 488 conjugated phalloidin | Invitrogen | A12370 | |
| Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A | Millipore | 05-829X-555 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) | Invitrogen | A21112 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | |
| Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21070 | |
| Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa | BD Pharmingen | 553343 | |
| C57BL/6 J Mice | Jackson Laboratories | 64 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Leica TCS SP5 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | D1306 | aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C |
| Inverted fluorescent wide field microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Ketamine (Narketan) | Vetoquinol | 100 mg/ml | Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock |
| Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) | Invitrogen | 459240 | |
| Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) | Invitrogen | A-21351 | |
| Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) | Invitrogen | 16-5941-82 | |
| Pierce 660 nm protein assay | Thermoscientific | 22660 | |
| Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG | Abcam | ab2904 | |
| Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) | Invitrogen | 14-6093-81 | |
| Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) | Invitrogen | 16-9668-82 | |
| Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 53-5931-82 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) | BD Pharmingen | 553142 | |
| Reduced mitotracker orange | Invitrogen | M7511 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 20 mg/ml | Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock |
References
- Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).
- Aulakh, G. K. Neutrophils in the lung: “the first responders”. Cell Tissue Research. , (2017).
- Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).
- Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).
- Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).
- Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils. Cell Tissue Research. , (2013).
- Cakmak, S., et al. Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone. Environment International. 111, 200-211 (2018).
- Dauchet, L., et al. Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults. Environment International. 121, 610-619 (2018).
- Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).
- Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects. Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).
- Rush, B., et al. Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome. Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).
- Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States. Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).
- Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada. Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).
- Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone. Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).
- Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury. Physiological Reports. 8 (11), 14463 (2020).
- Aulakh, G. K., et al. Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging. Scientific Reports. 10 (1), 15699 (2020).
- Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, 24 (2008).
- Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
- Southam, D. S., Dolovich, M., O’Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).
- Aulakh, G. K. Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation. Cell Tissue Research. , (2020).
- Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
- Yipp, B. G., et al. The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection. Science Immunology. 2 (10), (2017).
- Lee, T. Y., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
- Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications. Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).
- Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). 생화학. 54 (33), 5185-5197 (2015).
- Oosting, R. S., et al. Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells. American Journal of Physiology. 262 (1), 63-68 (1992).
- Roth, S., et al. Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol. Cell Death & Discovery. 1, 15056 (2015).
- Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development. Cells. 8 (2), (2019).
- Gupta, A., et al. Extrapulmonary manifestations of COVID-19. Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).
- Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. . 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).
- Aulakh, G. K., et al. Multiple image x-radiography for functional lung imaging. Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009 (2018).
