게놈은 핵 공간에서 염색체 형성 포획 기술을 통해 드러나게 할 수 있는 다른 구조물로 조직됩니다. 핵 내 Hi-C 방법은 드로소필라 세포주에서 크로마티닌 상호작용의 게놈 전체 컬렉션을 제공하며, 이는 제한 단편 수준에서 메가베이스 해상도로 탐색할 수 있는 접촉 맵을 생성합니다.
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이 논문에서
요약
초록
게놈은 도메인 간의 상호 작용을 격리하는 경계에 의해 구분되는 토폴로지적으로 연관된 도메인(TADs)으로 구성됩니다. Drosophila에서 TAD 형성과 경계의 기본 메커니즘은 여전히 조사 중입니다. 여기에 설명된 핵 내 Hi-C 방법의 적용은 노치 유전자를 분리하는 TAD 경계에서 건축 단백질(AP)결합 부위의 기능을 해부하는 데 도움이 되었다. AP의 손실을 일으키는 도메인 경계의 유전자 변형은 TAD 융합, 전사 결함 및 장거리 토폴로지 변경을 초래합니다. 이 결과는 Drosophila에 있는 도메인 경계 형성 및 유전자 발현 통제에 유전 요소의 기여를 보여주는 증거를 제공했습니다. 여기서, 핵 내 Hi-C 방법은 프로토콜과 함께 실험의 품질을 평가하기 위한 중요한 체크포인트를 제공하는 상세하게 기술되었다. 또한 다른 게놈 비늘에서 게놈 상호 작용을 분석하기 위해 시퀀싱 판독 및 유효한 Hi-C 쌍의 필요한 숫자가 도시되어 있습니다. CRISPR/Cas9 매개 유전자 편집 은 규제 요소의 유전자 편집 및 이 핵 내 Hi-C 프로토콜을 사용하여 게놈 상호 작용의 고해상도 프로파일링은 유전 적 요소의 구조적 기능의 조사를위한 강력한 조합이 될 수 있습니다.
서론
진핵생물에서, 게놈은1단계도중 핵 공간에 있는 특정 영토를 차지하는 염색체로 분할된다. 염색체를 형성하는 염색체는 두 개의 주요 국가로 나눌 수 있습니다: 전사적으로 허용되는 접근 가능한 크로마틴 의 하나, 그리고 전사적으로 억압되는 소형 크로마틴의 다른. 이 크로마틴 상태는 핵2에두 개의 뚜렷한 구획을 형성하여 핵 공간에서 분리하고 거의 혼합되지 않습니다. 서브 메가베이스 척도에서 경계는 염색체조직3,4,5를표시하는 TAD라는 고주파 크로마틴 상호 작용의 도메인을 분리합니다. 포유류에서 TAD 경계는 응집력 및 CCCTC 결합 계수(CTCF)6,7,8에의해 점령된다. 응집력 복합체는 크롬라틴을 압출하고 유전체 서열에서 수렴 방향으로 배치되는 CTCF 결합 부위에서 정지하여 안정적인 크로마틴 루프9,
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프로토콜
1. 고정
- 1,000만 개의 슈나이더 라인 2 플러스(S2R+) 세포로 시작하여 실온(RT)에서 10%의 태아 소 혈청(FBS)을 함유한 슈나이더 배지에서 세포 현탁액 17.5mL를 준비합니다.
- 메탄올이 없는 포름알데히드를 첨가하여 최종 농도를 2%로 얻습니다. RT에서 10분 동안 혼합하고 인큐베이션을 사용하여 매 분마다 섞어 주시합니다.
참고: 포름알데히드는 유해 화학물질입니다. 적절한 건강 및 안전 규정을 따르고 연기 후드에서 작업하십시오. - 글리신을 첨가하여 반응을 담결하여 0.125 M의 최종 농도를 달성하고 혼합한다. RT에서 5분 동안 배양하고 얼음에 15분이 면됩니다.
- 400 × G의 원심분리기는 RT에서 5분 동안, 그리고 4°C에서 10분 동안; 상부체를 폐기합니다. 차가운 1x 인산염 완충식식염 의 25 mL에서 조심스럽게 펠릿을 다시 중단합니다.
- 4°C에서 10분 동안 400 × g의 원심분리기는 상수부를 폐기합니다.
참고: 프로토콜을 계속 계속하면 용해의 경우 2.1단계로 이동하십시오. 그렇지 않으면, 액체 N2에 펠릿을 플래시 동결하고 -80 °C에 펠릿을 저장합니다.
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결과
다음은 성공적인 Hi-C 프로토콜의 결과입니다(그림 1A의Hi-C 프로토콜 워크플로우 요약 참조). 핵 하이-C 실험 중에는 여러 가지 품질 관리 검사점이 있습니다. 샘플 알리쿼트는 (UD) 및 후 (D) 크로마틴 제한 단계뿐만 아니라 결찰 후(L)를 수집하였다. 크로스링크는 반전되었고, DNA는 정제되어 아가로즈 젤로 실행되었다. Mbo에 대한 제한이 성공했을 때 200-1000 bp의 얼룩이 관찰되었습니다(도1B). 분자의 예상 크기는 선택의 제한 효소에 따라 달라집니다. 결찰이 성공하면, 높은 분자량 대역이 겔의 상부에서보였다(도 1B). 소화 효율은 또한 프로토콜에 상세히 설명된 바와 같이 qPCR에 의해 확인될 수 있다. 허용 가능한 소화 효율은 80%이상입니다(그림 1C).
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토론
여기에 제시된 핵 내 Hi-C 방법은 고해상도로 드로소필라 게놈 토폴로지의 상세한 탐구를 허용하고, 발기인과 증강제 와 같은 조절 요소 간의 크로마틴 루프에서 부터 TAD 및 대형 구획식별(25)에이르기까지 다양한 게놈 비늘에서 게놈 상호 작용의 전망을 제공한다. 동일한 기술은 또한 일부 수정33을가진 포유류 조직에 효율적으로 적용되었습니다. 예를 들어, 단일 세포 현탁액 대신 조직을 처리하는 경우, 조직은 70 μm 필터를 통해 체질되고, 용해 단계는 Dounce 균질화제를 사용하여 물질을 균질화하면서 수행된다. 또한, 포유류 게놈이 Drosophila 게놈보다 25배 더 크므로 1-5 kb 해상도 행렬을 구축하는 데 필요한 유효한 판독 쌍의 수가 더 큽습니다. 상기 핵하이C 방식은 결찰 전 65°C에서 1% SDS로 핵용액을 회피하여 핵 무결성을 보존하고, 7mL23, 24대신 .......
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공개 사항
저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 UNAM 기술 혁신 및 연구 지원 프로그램 (PAPIIT) 교부금 번호 IN207319 및 과학기술 국가 위원회 (CONACyT-FORDECyT) 교부금 번호 303068 의해 지원되었다. A.E.L. 과학 기술 국가 위원회 (CONACyT) CVU 번호 968128 의해 지원 석사 학생입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 16%(vol/vol) 파라포름알데히드 용액 | Agar Scientific | R1026 | |
| Biotin-14-dATP | Invitrogen | CA1524-016 | |
| ClaI 효소 | NEB | R0197S | |
| COVARIS 초음파기 | Covaris | LE220-M220 | |
| Cut Smart | NEB | B72002S | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 1x | Life Technologies | 41965-039 | |
| Dynabeads, MyOne, 스트렙타비딘, C1 | Invitrogen | , 65002 | |
| 소 태아 혈청(FBS), 멸균 여과 | , Sigma | F9665 | |
| Klenow Dna, PolI, 대형 단편 | NEB | M0210L | |
| , Klenow 엑소(-) | NEB | M0210S | |
| , 결찰 완충액, | NEB | B020S | |
| MboI 효소 | NEB R0147M | ||
| NP40-Igepal | SIGMA | CA-420 | 용해 완충액 PE 어댑터에 첨가하기위한 비이온 성 계면 활성제 |
| 1.0 | Illumina | 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3'PE | |
| 어댑터 2.0 | Illumina | 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3'PE | |
| PCR 프라이머 1.0 | Illumina | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3'PE | |
| PCR 프라이머 2.0 | Illumina | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3'Phenol | |
| : Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA | P2069 | |
| Primer 1 (알려진 상호 작용, 그림 2A) | Sigma | 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'Primer | |
| 2 (알려진 상호 작용, 그림 2A) | Sigma | 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3' | |
| 프로테아제 억제제 칵테일 정제 | Roche | 4693132001 | |
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| Qubit | ThermoFisher | Q33327 | |
| RNAse | Roche | 10109142001 | |
| SPRI 비즈 | Beckman | B23318 | |
| T4 DNA 리가제 | Invitrogen | 15224-025 | |
| T4 DNA 중합효소 | NEB | M0203S | |
| T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 (PNK) | NEB | M0201L | |
| TaqPhusion | NEB | M0530S | DNA 중합효소 |
| Triton X-100 | SDS 담금질용 비이온 계면활성제 |
참고문헌
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interact....
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