Dispositifs électriques et magnétiques de champ pour la stimulation des tissus biologiques

Summary

Ce protocole décrit le processus étape par étape pour construire des stimulateurs électriques et magnétiques utilisés pour stimuler les tissus biologiques. Le protocole comprend une ligne directrice pour simuler les champs électriques et magnétiques informatiques et la fabrication d’appareils stimulateurs.

Abstract

Les champs électriques (FE) et les champs magnétiques (MF) ont été largement utilisés par l’ingénierie tissulaire pour améliorer la dynamique cellulaire comme la prolifération, la migration, la différenciation, la morphologie et la synthèse moléculaire. Cependant, des variables telles que la force de stimulus et les temps de stimulation doivent être considérées en stimulant des cellules, des tissus ou des échafaudages. Étant donné que les FE et les MF varient selon la réponse cellulaire, il n’est pas clair comment construire des dispositifs qui génèrent des stimuli biophysiques adéquats pour stimuler les échantillons biologiques. En fait, il y a un manque de preuves concernant le calcul et la distribution lorsque des stimuli biophysiques sont appliqués. Ce protocole est axé sur la conception et la fabrication d’appareils pour générer des FE et des MF et la mise en œuvre d’une méthodologie computationnelle pour prédire la distribution des stimuli biophysiques à l’intérieur et à l’extérieur des échantillons biologiques. Le dispositif EF était composé de deux électrodes parallèles en acier inoxydable situées au sommet et au bas des cultures biologiques. Les électrodes étaient reliées à un oscillateur pour générer des tensions (50, 100, 150 et 200 Vp-p) à 60 kHz. L’appareil MF était composé d’une bobine, qui a été dynamisé avec un transformateur pour générer un courant (1 A) et la tension (6 V) à 60 Hz. Un support en méthacrylate polyméthyle a été construit pour localiser les cultures biologiques au milieu de la bobine. La simulation computationnelle a élucidé la distribution homogène des FE et des MF à l’intérieur et à l’extérieur des tissus biologiques. Ce modèle informatique est un outil prometteur qui peut modifier des paramètres tels que les tensions, les fréquences, les morphologies tissulaires, les types de plaques de puits, les électrodes et la taille des bobines pour estimer les FE et les MF pour obtenir une réponse cellulaire.

Introduction

Il a été démontré que les FE et les MF modifient la dynamique cellulaire, stimulant la prolifération et augmentant la synthèse des principales molécules associées à la matrice extracellulaire des tissus¹. Ces stimuli biophysiques peuvent être appliqués de différentes façons en utilisant des paramètres et des dispositifs spécifiques. En ce qui concerne les dispositifs de générer des FE, les stimulateurs de couplage direct utilisent des électrodes qui sont en contact avec des échantillons biologiques in vitro ou implantées directement dans les tissus des patients et des animaux in vivo^2; cependant, il y a encore des limitations et des insuffisances qui incluent la biocompatibilité insuffisante par les électrodes en contact, les changements dans le pH et les niveaux moléculaires^{d’oxygène 1.} Au contraire, les dispositifs indirects de couplage produisent des EF entre deux électrodes, qui sont placées en parallèle aux échantillons^{biologiques 3,}permettant une technique alternative non invasive pour stimuler les échantillons biologiques et éviter le contact direct entre les tissus et les électrodes. Ce type d’appareil peut être extrapolé aux applications cliniques futures pour effectuer des procédures avec une invasion minimale au patient. En ce qui concerne les appareils qui génèrent des MF, les stimulateurs de couplage inductifs créent un courant électrique variable dans le temps, qui traverse une bobine qui se trouve autour des cultures^{cellulaires 4,5}. Enfin, il existe des dispositifs combinés, qui utilisent des FE et des MF statiques pour générer des champs électromagnétiques transitoires¹. Étant donné qu’il existe différentes configurations pour stimuler les échantillons biologiques, il est nécessaire de tenir compte de variables telles que la tension et la fréquence lorsque des stimuli biophysiques sont appliqués. La tension est une variable importante, car elle influence le comportement des tissus biologiques; par exemple, il a été démontré que la migration cellulaire, l’orientation et l’expression des gènes dépendent de l’amplitude de la tension^{appliquée 3,6,7,8,9,10}. La fréquence joue un rôle important dans la stimulation biophysique, car il a été démontré que ceux-ci se produisent naturellement in vivo. Il a été démontré que les fréquences élevées et basses ont des effets bénéfiques sur les cellules; en particulier, dans les canaux calciques à barrière de tension de membrane cellulaire ou le réticulum endoplasmique, qui déclenchent différentes voies de signalisation au niveau intracellulaire^1,7,11.

Selon ce qui précède, un dispositif pour générer des FE se compose d’un générateur de tension relié à deux condensateurs parallèles¹². Ce dispositif a été mis en œuvre par Armstrong et coll. pour stimuler à la fois le taux prolifératif et la synthèse moléculaire des chondrocytes¹³. Une adaptation de cet appareil a été réalisée par Brighton et coll. qui ont modifié les plaques de puits de la culture cellulaire en perçant leurs couvercles supérieur et inférieur. Les trous ont été remplis par des glissières de couverture, où les verres du bas ont été utilisés pour la culture des tissus biologiques. Des électrodes ont été placées sur chaque glissière de couverture pour générer des^{FE 14.} Ce dispositif a été employé pour stimuler électriquement des chondrocytes, des osteoblastes et des explants de cartilage, montrant une augmentation de^{la prolifération cellulaire 14,15,16} et synthèse moléculaire^3,17. L’appareil conçu par Hartig et coll. se composait d’un générateur d’ondes et d’un amplificateur de tension, qui étaient reliés à des condensateurs parallèles. Les électrodes étaient faites d’acier inoxydable de haute qualité situé dans un étui isolant. Le dispositif a été employé pour stimuler des osteoblastes, montrant une augmentation significative de la prolifération et de la sécrétion de^{protéine 18.} L’appareil utilisé par Kim et coll. se composait d’une puce stimulateur biphasique du courant, qui a été construite à l’aide d’un procédé de fabrication de semi-conducteurs complémentaires d’oxyde métallique à haute tension. Une plaque de puits de culture a été conçue pour la culture des cellules sur une surface conductrice avec stimulation électrique. Les électrodes étaient recouvertes d’or sur des plaques de^{silicium 19}. Ce dispositif a été employé pour stimuler des osteoblastes, montrant une augmentation de la prolifération et de la synthèse du facteur de croissance endothélial vasculaire^19,et stimulant la production de l’activité alcaline de phosphatase, du dépôt de calcium et des protéines morphogenic^{d’os 20.} De même, ce dispositif a été employé pour stimuler le taux prolifératif et l’expression du facteur de croissance endothélial vasculaire des cellules souches mésenchymales de moelle^{osseuse humaine 21.} L’appareil conçu par Nakasuji et coll. était composé d’un générateur de tension relié à des plaques de platine. Des électrodes ont été construites pour mesurer le potentiel électrique à 24 points différents. Ce dispositif a été employé pour stimuler des chondrocytes, montrant que les EF n’ont pas modifié la morphologie cellulaire et la prolifération accrue et la synthèse moléculaire^22. L’appareil utilisé par Au et coll. se composait d’une chambre en verre équipée de deux tiges de carbone reliées à un stimulateur cardiaque avec des fils de platine. Ce stimulateur a été employé pour stimuler des cardiomyocytes et des fibroblastes, améliorant l’allongement cellulaire et l’alignement de fibroblaste^23.

Différents dispositifs MF ont été fabriqués à partir de bobines Helmholtz pour stimuler plusieurs types d’échantillons biologiques. Par exemple, les bobines d’Helmholtz ont été employées pour stimuler la prolifération et la synthèse moléculaire des chondrocytes^24,25,pour augmenter la synthèse protéoglycane des explants 26 de cartilage^articulaire,pour améliorer l’upregulation de gène liée à la formation d’os des cellules osteoblast-like^27,et pour augmenter la prolifération et l’expression moléculaire des cellules endothéliales^28. Les bobines Helmholtz génèrent des MFs sur deux bobines situées l’une devant l’autre. Les bobines doivent être placées avec une distance égale au rayon des bobines pour assurer un MF homogène. L’inconvénient d’utiliser les bobines Helmholtz réside dans les dimensions de bobine, parce qu’elles doivent être assez grandes pour générer l’intensité MF requise. En outre, la distance entre les bobines doit être suffisante pour assurer une distribution homogène des MF autour des tissus biologiques. Pour éviter les problèmes causés par les bobines Helmholtz, différentes études ont été axées sur la fabrication de bobines solénoïdes. Les bobines de solénoïde sont basées sur un tube, qui est enroulé avec du fil de cuivre pour générer des MFs. Les entrées de fil de cuivre peuvent être reliées directement à la prise ou à une alimentation électrique pour dynamiser la bobine et créer des MFs au centre du solénoïde. Plus la bobine tourne, plus le MF généré. La magnitude MF dépend également de la tension et du courant appliqués pour dynamiser la bobine²⁹. Bobines séloïdes ont été utilisés pour stimuler magnétiquement différents types de cellules telles que HeLa, HEK293 et MCF7³⁰ ou cellules souches mésenchymales³¹.

Les dispositifs utilisés par différents auteurs n’ont pas considéré ni la taille adéquate des électrodes ni la longueur correcte de la bobine pour distribuer homogènement les FE et les MF. En outre, les appareils génèrent des tensions et des fréquences fixes, limitant leur utilisation pour stimuler des tissus biologiques spécifiques. Pour cette raison, dans ce protocole, une ligne directrice de simulation computationnelle est effectuée pour simuler à la fois les systèmes capacitifs et les bobines afin d’assurer une distribution homogène des FE et des MF sur les échantillons biologiques, en évitant l’effet de bord. En outre, il est démontré que la conception de circuits électroniques génère des tensions et la fréquence entre les électrodes et la bobine, la création d’EFs et MFs qui surmonteront les limitations causées par l’impedance de la culture cellulaire bien plaques et de l’air. Ces modifications permettront la création de bioréacteurs non invasifs et adaptatifs pour stimuler tout tissu biologique.

Protocol

1. Simulation des FE et des MF REMARQUE : La simulation des FE et des MF a été réalisée en multiphysique COMSOL. Sélectionnez une configuration 2D axisymétrique pour représenter à la fois les domaines électriques et magnétiques. Dans la configuration physic, sélectionnez soit l’interface Courant électrique pour calculer les EF dans des électrodes parallèles, soit l’interface Champ magnétique pour calculer les MF autour de…

Representative Results

Simulation computationnelleLes distributions de FE et de MF sont indiquées à la figure 3. D’une part, il a été possible d’observer la répartition homogène des FE dans le système capacitif (figure 3A). L’EF a été tracé pour observer en détail l’ampleur du champ à l’intérieur de l’échantillon biologique( figure 3B). Cette simulation a été utile pour paramétiser la taille des électrode…

Discussion

Les traitements utilisés pour guérir différentes pathologies qui affectent les tissus humains sont des thérapies pharmacologiques³² ou des interventions^{chirurgicales 33}, qui cherchent à soulager la douleur localement ou remplacer les tissus affectés par des explantations ou des greffes. Récemment, la thérapie cellulaire autologue a été proposée comme thérapie alternative pour traiter les tissus blessés, où les cellules sont isolées du patient et élargies, pa…

Materials

Electrical stimulator
Operational amplifier	Motorola	LF-353N	—- Quantity: 1
Resistors	—-	—-	22 kΩ Quantity: 1
Resistors	—-	—-	10 kΩ Quantity: 3
Resistors	—-	—-	2.6 kΩ Quantity: 2
Resistors	—-	—-	2.2 kΩ Quantity: 1
Resistors	—-	—-	1 kΩ Quantity: 1
Resistors	—-	—-	220 Ω Quantity: 2
Resistors	—-	—-	22 Ω Quantity: 5
Resistors	—-	—-	10 Ω Quantity: 1
Resistors	—-	—-	6.8 Ω Quantity: 1
Resistors	—-	—-	3.3 Ω Quantity: 2
Polyester capacitors	—-	—-	1 nF Quantity: 2
Polyester capacitors	—-	—-	100 nF Quantity: 1
VHF Band Amplifier Transistor JFET	Toshiba	2SK161	—- Quantity: 1
Power transistor BJT NPN	Mospec	TIP 31C	—- Quantity: 1
Zener diode	Microsemi	1N4148	—- Quantity: 1
Switch	Toogle Switch	SPDT – T13	—- Quantity: 3
Toroidal ferrite core	Caracol	—-	T*22*14*8 Quantity: 1
Cooper wire	Greenshine	—-	AWG – 24 Quantity: 1
Relimate header with female housing	ADAFRUIT	—-	8 pin connectors Quantity: 1
Relimate header with female housing	ADAFRUIT	—-	2 pin connectors Quantity: 1
Female plug terminal connector	JIALUN	—-	4mm Lantern Plugs (Plug + Socket) 15 A Quantity: 1
Aluminum Heat Sink	AWIND	—-	For TIP 31C transistor Quantity: 1
Led	CHANZON	—-	5 mm red Quantity: 1
Integrated circuit socket connector	Te Electronics Co., Ltd.	—-	Double row 8-pin DIP Quantity: 1
3 pin connectors set	STAR	—-	JST PH 2.0 Quantity: 3
2 pin screw connectors	STAR	—-	For PCB Quantity: 1
3 pin screw connectors	STAR	—-	For PCB Quantity: 1
Banana connector test lead	JIALUN	—-	P1041 – 4 mm – 15 A Quantity: 7
Bullet connectors to banana plug charge lead	JIALUN	—-	4 mm male-male/female-female adapters – 15 A Quantity: 1
Case	—-	—-	ABS Quantity: 1
Electrodes	—-	—-	Stainless – steel Quantity: 2
Electrode support	—-	—-	Teflon Quantity: 2
Printed circuit board			Quantity: 1
Magnetic stimulator
Cooper wire	Greenshine	—-	AWG – 18 Quantity: 1
AC power plugs	—-	—-	120 V AC – 60 Hz Quantity: 1
Banana female connector test lead	JIALUN	—-	1Set Dual Injection – 4 mm – 15 A Quantity: 2
Banana male connector test lead	JIALUN	—-	1Set Dual Injection – 4 mm 15 A Quantity: 1
Cell culture well plate support	—-	—-	PMMA Quantity: 1
Fuse	Bussmann	2A	—- Quantity: 1
Transformer	—-	—-	1A – 6 V AC Quantity: 1
Tube	—-	—-	PVC Quantity: 1
Variable rheostat	MCP	BXS150	10 Ω Quantity: 1
General equipment
Digital dual source	PeakTech	DG 1022Z	2 x 0 – 30 V / 0 – 5 A CC / 5 V / 3 A fijo Quantity: 1
Digital Oscilloscope	Rigol	DS1104Z Plus	100 MHz, bandwidth, 4 channels Quantity: 1
Digital multimeter	Fluke	F179	Voltage CC – CA (1000 V). Current CC – CA 10 A. Frequency 100 kHz Quantity: 1