生体組織の刺激のための電界・磁場装置
Summary
このプロトコルは、生物学的組織を刺激するために使用される電気および磁気刺激装置の両方を構築するためのステップバイステップのプロセスを記述する。このプロトコルには、計算上の電界と磁場をシミュレートし、刺激装置の製造をシミュレートするためのガイドラインが含まれています。
Abstract
電界(EF)や磁場(MF)は、増殖、移動、分化、形態、分子合成などの細胞ダイナミクスを改善するために、組織工学によって広く使用されてきました。しかし、細胞、組織、または足場を刺激する際には、刺激強度や刺激時間などの変数を考慮する必要があります。EFとMFは細胞の反応によって変化することを考えると、生物学的サンプルを刺激するために十分な生物物理学的刺激を生成するデバイスを構築する方法は不明です。実際、生物物理学的刺激が適用される場合の計算と分布に関する証拠が不足しています。このプロトコルは、EFやMFを生成するデバイスの設計と製造、および生物学的サンプルの内外の生物物理学的刺激分布を予測する計算方法論の実施に焦点を当てています。EF装置は、生物学的培養物の上部と下部に位置する2つの平行なステンレス鋼電極で構成された。電極を発振器に接続して、60kHzで電圧(50、100、150、200 Vp-p)を発生させた。MF装置はコイルで構成され、変圧器で通電し、60Hzで電流(1A)と電圧(6V)を発生させた。ポリメチルメタクリレート支持体は、コイルの真ん中に生物学的培養物を見つけるために構築されました。計算シミュレーションは、生物学的組織の内外のEFとMFの均質な分布を解明した。この計算モデルは、電圧、周波数、組織形態、ウェルプレートタイプ、電極およびコイルサイズなどのパラメータを変更して、細胞応答を達成するためにEFsおよびMFを推定できる有望なツールです。
Introduction
EFおよびMFは、細胞のダイナミクスを改変し、組織1の細胞外マトリックスに関連する主分子の増殖を刺激し、合成を増加させることが示されている。これらの生物物理学的刺激は、特定の設定やデバイスを使用して、さまざまな方法で適用することができます。EFを生成するデバイスに関しては、直接結合刺激装置は、生体外の生体試料に接触しているか、生体内で患者および動物の組織に直接移植された電極を使用する2;しかしながら、電極間の接触による生体適合性の不十分、pHおよび分子酸素レベル1の変化を含む制限および欠陥が依然として存在する。逆に、間接的なカップリングデバイスは、生物学的サンプル3と並行して配置される2つの電極間にEFを生成し、生物学的サンプルを刺激し、組織と電極の間の直接接触を避けるために非侵襲的な代替技術を可能にする。このタイプの装置は患者への最低の侵略のプロシージャを行うために将来の臨床適用に外挿することができる。MFを生成するデバイスに関連して、誘導結合刺激装置は、細胞培養4、5の周りに位置するコイルを流れる時間変動電流を作成します。最後に、EF と静的 MF を使用して一過性電磁界1を生成する複合デバイスがあります。生物学的サンプルを刺激する構成が異なることを考えると、生体物理学的刺激を適用する際には、緊張や周波数などの変数を考慮する必要があります。電圧は生体組織の挙動に影響を与えるため、重要な変数です。例えば、細胞の移動、配向、遺伝子発現は印加電圧3、6、7、8、9、10の振幅に依存することが示されている。生体内で発生することが証明されているので、周波数は生体物理学的刺激に重要な役割を果たします。高低周波数は細胞に有益な効果を有することが実証されている。特に、細胞膜の電圧ゲート型カルシウムチャネルまたは小胞体では、細胞内レベル1、7、11において異なるシグナル伝達経路を引き起こす。
上記に従って、EFsを生成する装置は、2つの並列コンデンサ12に接続された電圧発生器から構成される。この装置は、アームストロングらによって実施され、軟骨細胞13の増殖速度および分子合成の両方を刺激する。この装置の適応は、上蓋と底蓋を掘削することによって細胞培養井戸プレートを改変したBrightonららによって行われた。穴はカバースライドで満たされ、下の眼鏡は生物学的組織を培養するために使用された。電極は各カバースライドに配置され、EFs14を生成した。この装置は、軟骨細胞、骨芽細胞および軟骨外植物を電気的に刺激するために用いられ、細胞増殖14、15、16および分子合成3、17の増加を示す。 Hartigらによって設計された装置は、平行コンデンサに接続された波発生器と電圧増幅器で構成されていた。電極は絶縁の場合に置かれた高品質のステンレス鋼から成っていた。この装置は、骨芽細胞を刺激するために使用され、増殖およびタンパク質分泌18の有意な増加を示す。Kimらが使用する装置は、高電圧金属酸化物の相補半導体の製造プロセスを用いて製造された二相電流刺激チップで構成されていた。培養井戸プレートは、電気刺激で導電性表面上の細胞を培養するように設計された。電極はシリコンプレート19の上に金で被覆した。この装置は、骨芽細胞を刺激するために使用され、血管内皮増殖因子19の増殖及び合成の増加を示し、アルカリホスファターゼ活性の産生を刺激し、カルシウム沈着及び骨形態形成タンパク質20を刺激する。同様に、本装置は、ヒト骨髄間葉系幹細胞21の血管内皮増殖因子の増殖速度および発現を刺激するために用いた。中鈴路らで設計された装置は、白金プレートに接続された電圧発生器で構成された。電極は24の異なった点で電位を測定するために造られた。この装置は軟骨細胞を刺激するために用いられ、EFは細胞形態を変化させなかったことを示し、増殖および分子合成22を増加させた。Auらで使用される装置は、白金線で心臓刺激装置に接続された2本のカーボンロッドを備えたガラス室から構成された。この刺激剤は、心筋細胞および線維芽細胞を刺激するために用いられ、細胞伸長及び線維芽細胞の配向性23を改善する。
さまざまなMFデバイスは、いくつかのタイプの生物学的サンプルを刺激するために、ヘルムホルツコイルに基づいて製造されています。例えば、ヘルムホルツコイルは、軟骨細胞24,25の増殖および分子合成を刺激するために使用されてきたが、関節軟骨外植物26のプロテオグリカン合成を増強し、骨芽細胞様細胞27の骨形成に関連する遺伝子のアップレギュレーションを改善し、内皮細胞28の増殖および分子発現を増加させる。ヘルムホルツコイルは、一方が他方のコイルの前に位置する2つのコイル全体でMFを生成します。コイルは、均質なMFを確保するために、コイルの半径と等しい距離で配置する必要があります。ヘルムホルツコイルを使用することの欠点は、必要なMF強度を生成するのに十分な大きさである必要があるため、コイル寸法にあります。さらに、コイル間の距離は、生物学的組織の周りのMFの均質な分布を確保するために十分でなければなりません。ヘルムホルツコイルによる問題を回避するために、ソレノイドコイルの製造にさまざまな研究が焦点を当てています。ソレノイドコイルは、銅線で巻かれたチューブをベースにしてMFを生成します。銅線入力をコンセントまたは電源に直接接続してコイルを通電し、ソレノイドの中央にMFsを作成することができます。コイルの回転数が多いほど、生成されるMFは大きくなります。MFの大きさはまた、コイル29を通電するために印加される電圧および電流に依存する。ソレノイドコイルは、HeLa、HEK293およびMCF730または間葉系幹細胞31のような磁気的に異なる種類の細胞を刺激するために使用されてきた。
異なる著者が使用するデバイスは、電極の十分なサイズまたはEFとMFの両方を均質に分配するためにコイルの正しい長さを考慮していません。さらに、デバイスは固定電圧と周波数を生成し、特定の生体組織を刺激するための使用を制限します。このため、このプロトコルでは、容量性システムとコイルの両方をシミュレーションして、生物学的サンプル上のEFとMFの均質な分布を保証し、エッジ効果を回避するための計算シミュレーションガイドラインが実施される。また、電子回路の設計により、電極とコイルの間に電圧と周波数が発生し、細胞培養井戸プレートや空気のインピーダンスによる制限を克服するEFやMFが生まれることが示されています。これらの改変は、非侵襲的で適応性のあるバイオリアクターを作成し、任意の生物学的組織を刺激することを可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
ヒト組織に影響を及ぼす異なる病理を治癒するために使用される治療は、局所的に痛みを和らげるか、または影響を受けた組織を外植または移植に置き換えようとする薬理学的療法32または外科的介入33である。近年、自家細胞療法は、傷害組織を治療するための代替療法として提案されており、そこで細胞は患者から単離され、インビトロ技術を介して、…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、「フォンド・ナシオナル・デ・フィナンシアミエント・パラ・ラ・シエンシア、 ラ・テクノロジア、イ・ラ・イノバシオン -フォンド・フランシスコ・ホセ・デ・カルダス-ミンシエンシアス」とコロンビア大学ナシオナル・デ・コロンビア交付金第80740-290-2020号とヴァルチームテックが受けたサポート – ビデオ版の機器と技術サポートを提供するための 研究と革新 。
Materials
| Electrical stimulator | |||
| Operational amplifier | Motorola | LF-353N | —- Quantity: 1 |
| Resistors | —- | —- | 22 kΩ Quantity: 1 |
| Resistors | —- | —- | 10 kΩ Quantity: 3 |
| Resistors | —- | —- | 2.6 kΩ Quantity: 2 |
| Resistors | —- | —- | 2.2 kΩ Quantity: 1 |
| Resistors | —- | —- | 1 kΩ Quantity: 1 |
| Resistors | —- | —- | 220 Ω Quantity: 2 |
| Resistors | —- | —- | 22 Ω Quantity: 5 |
| Resistors | —- | —- | 10 Ω Quantity: 1 |
| Resistors | —- | —- | 6.8 Ω Quantity: 1 |
| Resistors | —- | —- | 3.3 Ω Quantity: 2 |
| Polyester capacitors | —- | —- | 1 nF Quantity: 2 |
| Polyester capacitors | —- | —- | 100 nF Quantity: 1 |
| VHF Band Amplifier Transistor JFET | Toshiba | 2SK161 | —- Quantity: 1 |
| Power transistor BJT NPN | Mospec | TIP 31C | —- Quantity: 1 |
| Zener diode | Microsemi | 1N4148 | —- Quantity: 1 |
| Switch | Toogle Switch | SPDT – T13 | —- Quantity: 3 |
| Toroidal ferrite core | Caracol | —- | T*22*14*8 Quantity: 1 |
| Cooper wire | Greenshine | —- | AWG – 24 Quantity: 1 |
| Relimate header with female housing | ADAFRUIT | —- | 8 pin connectors Quantity: 1 |
| Relimate header with female housing | ADAFRUIT | —- | 2 pin connectors Quantity: 1 |
| Female plug terminal connector | JIALUN | —- | 4mm Lantern Plugs (Plug + Socket) 15 A Quantity: 1 |
| Aluminum Heat Sink | AWIND | —- | For TIP 31C transistor Quantity: 1 |
| Led | CHANZON | —- | 5 mm red Quantity: 1 |
| Integrated circuit socket connector | Te Electronics Co., Ltd. | —- | Double row 8-pin DIP Quantity: 1 |
| 3 pin connectors set | STAR | —- | JST PH 2.0 Quantity: 3 |
| 2 pin screw connectors | STAR | —- | For PCB Quantity: 1 |
| 3 pin screw connectors | STAR | —- | For PCB Quantity: 1 |
| Banana connector test lead | JIALUN | —- | P1041 – 4 mm – 15 A Quantity: 7 |
| Bullet connectors to banana plug charge lead | JIALUN | —- | 4 mm male-male/female-female adapters – 15 A Quantity: 1 |
| Case | —- | —- | ABS Quantity: 1 |
| Electrodes | —- | —- | Stainless – steel Quantity: 2 |
| Electrode support | —- | —- | Teflon Quantity: 2 |
| Printed circuit board | Quantity: 1 | ||
| Magnetic stimulator | |||
| Cooper wire | Greenshine | —- | AWG – 18 Quantity: 1 |
| AC power plugs | —- | —- | 120 V AC – 60 Hz Quantity: 1 |
| Banana female connector test lead | JIALUN | —- | 1Set Dual Injection – 4 mm – 15 A Quantity: 2 |
| Banana male connector test lead | JIALUN | —- | 1Set Dual Injection – 4 mm 15 A Quantity: 1 |
| Cell culture well plate support | —- | —- | PMMA Quantity: 1 |
| Fuse | Bussmann | 2A | —- Quantity: 1 |
| Transformer | —- | —- | 1A – 6 V AC Quantity: 1 |
| Tube | —- | —- | PVC Quantity: 1 |
| Variable rheostat | MCP | BXS150 | 10 Ω Quantity: 1 |
| General equipment | |||
| Digital dual source | PeakTech | DG 1022Z | 2 x 0 – 30 V / 0 – 5 A CC / 5 V / 3 A fijo Quantity: 1 |
| Digital Oscilloscope | Rigol | DS1104Z Plus | 100 MHz, bandwidth, 4 channels Quantity: 1 |
| Digital multimeter | Fluke | F179 | Voltage CC – CA (1000 V). Current CC – CA 10 A. Frequency 100 kHz Quantity: 1 |
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