아라비도시스에서 지역 및 전신 상처 신호의 넓은 필드, 실시간 이미징

Summary

세포외 글루타메이트 트리거 전신 칼슘 신호는 식물의 기계적 상처 및 초식 공격에 대한 식물 방어 대응의 유도에 매우 중요합니다. 이 문서에서는 칼슘과 글루타민염에 민감한 형광 바이오 센서를 표현하는 아라비도시스 탈리아나 식물을 사용하여 이러한 두 요인의 공간 적 및 측두동을 시각화하는 방법을 설명합니다.

Abstract

식물은 손상된 부품과 손상되지 않은 부품 모두에서 방어 반응을 유도하여 상처및 허브아이보리와 같은 기계적 응력에 반응합니다. 잎이 감기 시, 세포색 칼슘 이온 농도의 증가 (Ca²⁺ 신호) 상처 부위에서 발생. 이 신호는 방어 응답이 활성화되는 손상되지 않은 나뭇잎으로 빠르게 전송됩니다. 우리의 최근 연구는 그(것)들의 주위에 apoplast로 잎의 부상당한 세포에서 누설하는 글루타민이 상처 신호 역할을 한다는 것을 밝혔습니다. 이 글루타민은 글루타민산 수용체와 같은 Ca²⁺ 투과성 채널을 활성화하여 공장 전체에서 장거리 Ca²⁺ 신호 전파로 이어집니다. 이러한 이벤트의 공간적 및 현세적 특성은 유전적으로 인코딩된 형광 바이오 센서를 표현하는 살아있는 식물의 실시간 이미징으로 캡처할 수 있습니다. 여기서 우리는 상처에 대응하여 발생하는 아포가소성 글루타민의 Ca²⁺ 신호 및 변경의 역학을 모니터링하는 식물 전체의 실시간 이미징 방법을 소개합니다. 이 접근법은 광야 형광 현미경 및 녹색 형광 단백질 (GFP)기반Ca²⁺ 및 글루타민산 바이오 센서를 표현하는 형질 전환 성 애기장 식물을 사용합니다. 또한, 우리는 쉽게 상처 유도, 글루타민시 트리거 빠른 장거리 Ca^{2 +} 신호 전파를 유도하는 방법론을 제시한다. 이 프로토콜은 또한 공장 시스템 신호가 신호 및 응답 네트워크에 어떻게 관여할 수 있는지 조사하는 데 도움이 되는 다른 플랜트 스트레스에 대한 연구에 적용할 수 있습니다.

Introduction

식물은 생물학적 스트레스, 예를 들어 곤충이 먹이를 주는 것에서 벗어날 수 없으므로 정교한 응력 감지 및 신호 변환 시스템을 진화하여 허브 리보리^1과같은 문제로부터 자신을 감지하고 보호합니다. 상처 나 초식 포동 공격에 따라 식물은 부상당한 부위뿐만 아니라 손상되지 않은 탈설 기관^2에서식물 호르몬 자스모산 (JA)의 축적을 포함한 신속한 방어 반응을 시작합니다. 이 JA는 둘 다 직접 손상된 조직에서 방어 반응을 유발하고 공장의 손상되지 않은 부분에서 방어를 선제적으로 유도합니다. 애기독증에서,상처에 의해 유도된 JA의 축적은 식물내 다른 곳에서 손상된 단 몇 분 이내에 손상된 단 몇 분 이내에 손상된 잎에서 검출되었다^3. Ca^2+,반응성 산소 종(ROS) 및 전기 신호와 같은 여러 후보는 식물^4,5에서이러한 장거리 상처 신호로 작용하도록 제안되었습니다.

Ca^2+는 진핵 생물에서 가장 다재다능하고 유비쿼터스 두 번째 메신저 요소 중 하나입니다. 식물에서, 애....

Protocol

1. 식물 재료 준비

1. 1.5mL 마이크로튜브에서 표면은 GCaMP3 또는 CHIB-iGluSnFR을 3분 동안 20%(v/v) NaClO로 흔들어 서 아기방시스 탈리아나(Col-0 accession) 식물의 씨앗을 살균한 다음 멸균 증류수로 5회 세척합니다.
   참고: GCaMP3 또는 CHIB-iGluSnFR을 표현하는 애기장염의 형질전환선은 이전에^{설명되었습니다 6.}
2. 멸균 후드에 30mL 멸균(autoclaved) 무라시게와 스쿠그(MS) 매체[1x MS 염)로 채워진 10cm 정사각형 플라스틱 페트리 접시에 13개의 표면 멸균 씨앗을 뿌리고, 1% (w/v) 자당, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES 및 0.5% (w/v) 겔란 껌; pH 5.7 조정 1N KOH]. 뚜껑을 교체하고 수술 용 테이프로 포장하십시오.
3. 2일 동안 4°C에서 어두움으로 배양한 후, 연속광(90-100 μmol^{m-2 s-1)에서}22°C로 수평으로 플레이트를 배치하여 사용하기 전에 약 2주 동안 한다. 2 주 후, 가장 오래된에서 막내⁴⁴

Results

[Ca^2+]_시동및 【글루】아포의 신호 전파는 도 3, 도 4, 무비 S1및 영화 S2에제시된다. GCaMP3(0s)를 발현하는 식물에서 잎 1의 잎 1을 절단하면 혈관 (40 s)을 통해 로컬로 빠르게 유도된 [Ca^2+]_시트의 상당한 증가를 주도하였다(도3 및 무비 S1). 이어서, 신호는 몇 분 이내에 이웃 잎(잎 3 및 6)(그림3 및 무비 S1)으로급속히 전파되었다.

Discussion

발전소는 지역화된 외부 환경 자극에 대응한 다음 전체 식물 수준에서 항상성을 유지하는 데 중요합니다. 동물과 같은 첨단 신경계를 장착하지는 않지만, 이동식 전기(및 유압) 신호및 ROS 와 Ca^2+46,47의전파와 같은 요인에 따라 기관 안팎에서 신속한 통신을 사용합니다. 위에서 설명한 프로토콜은 상처에 대한 응답으로 Ca²⁺ 및 아포가소성 글루타민의 역학을 모니터링하여 이 신호 시스템의 활성을 식물 전체에 실시간으로 이미징할 수 있습니다. 이 방법은 높은 현공간 적 해상도와 사용 편의성을 결합한 식물의 신속하고 장거리 신호를 이해하는 강력한 도구를 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 Ca²⁺ 채널 차단제(예를 들어, LaCl 3) 또는 기타 잠재적 키 신호^활동의억제제(예를 들어, LaCl 3) 또는 다른 잠재적 키 신호 활동의.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arabidopsis expressing GCaMP3	Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR	사이타마 대학
GraphPad Prism 7	GraphPad 소프트웨어
L-글루타메이트	후지필름 Wako	072-00501	액체 성장 매체[1/2x MS 염, 1%(w/v) 수크로스 및 0.05%(w/v) MES, 1N KOH로 pH 5.1 조정]에 용해됨.
Microsoft Excel	Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) 매체	FUJIFILM Wako	392-00591	조성 : 1x MS 염, 1 % (w / v) 자당, 0.01 % (w / v) myoinositol, 0.05 % (w / v) MES 및 0.5 % (w / v) gellan gum; pH 5.7은 1N KOH로 조정되었습니다.
니콘 SMZ25 실체 현미경	니콘
NIS-Elements AR 분석	니콘
1x 대물 렌즈 (P2-SHR PLAN APO)	니콘
sCMOS 카메라 (ORCA-Flash4.0 V2)	하마 마츠 포토닉스	C11440-22CU
스퀘어 플라스틱 페트리 접시	Simport	D210-16