細胞外グルタミン酸誘発全身カルシウムシグナル伝達は、植物における機械的創傷および草食動物攻撃に対する植物防御応答の誘導にとって極めて重要である。本稿では、カルシウムとグルタミン酸に敏感な蛍光バイオセンサーを発現する シロイヌナズナ植物 を用いて、これらの要因の空間的および時間的ダイナミクスを可視化する方法について述べる。
植物は損傷や草藻などの機械的ストレスに反応し、損傷を受けた部分と遠位の損傷のない部分の両方で防御応答を誘導します。葉の傷を負った時、創傷部位で細胞細胞のカルシウムイオン濃度(Ca2+シグナル)の増加が起こる。この信号は、損傷していない葉に迅速に送信され、そこで防御応答が作動します。私たちの最近の研究は、葉の負傷した細胞から周囲のアポプラストに漏れるグルタミン酸が創傷信号として機能することを明らかにしました。このグルタミン酸はグルタミン酸受容体様Ca2+透過性チャネルを活性化し、植物全体に長距離Ca2+シグナル伝達をもたらす。これらの事象の空間的および時間的特性は、遺伝的にコードされた蛍光バイオセンサーを発現する生きている植物のリアルタイム画像化によって捉えることができる。ここでは、Ca2+シグナルのダイナミクスと、創傷に応答して発生する無熱性グルタミン酸の変化の両方を監視する植物全体のリアルタイムイメージング方法を紹介します。このアプローチでは、緑色蛍光タンパク質(GFP)ベースのCa2+およびグルタミン酸バイオセンサーを発現する広視野蛍光顕微鏡およびトランスジェニックシロイヌズン植物を使用しています。さらに、創傷誘発、グルタミン酸誘発の急速かつ長距離Ca2+シグナル伝播を容易に引き出す方法論を提示する。このプロトコルは、他の植物ストレスに関する研究にも適用され、植物の全身シグナリングがシグナリングおよび応答ネットワークにどのように関与しているかを調査するのに役立ちます。
植物は生物的ストレスから逃れることができない、例えば、昆虫がそれらに餌を与える、彼らは検出し、その後、草食1などの課題から身を守るために高度なストレスセンシングと信号伝達システムを進化させた。傷や草食動物の攻撃の際に、植物は負傷部位だけでなく損傷を受けていない遠位器官においても植物ホルモンジャスモン酸(JA)の蓄積を含む迅速な防御反応を開始する2。このJAは、両方の直接損傷した組織の防御応答をトリガし、先制的に、損傷していない部分の防御を誘導します。シロイヌナズナでは、傷によるJAの蓄積が遠位で検出され、無傷の葉は、傷ついた葉3から急速かつ長距離信号が伝達されていることを示唆する植物の他の場所で損傷のほんの数分の範囲内で検出された。Ca2+、活性酸素種(ROS)、および電気信号などのいくつかの候補は、植物4、5におけるこれらの長距離創傷信号として機能するように提案されている。
Ca2+は、真核生物の中で最も汎用性が高く、ユビキタスな第二のメッセンジャー要素の1つです。植物では、毛虫の咀嚼と機械的傷害は、傷ついた葉の中と傷ついていない遠葉6,7の両方で、細胞細胞体Ca2+濃度([Ca2+]cyt)の急激な増加を引き起こす。この全身Ca2+シグナルは、細胞内Ca2+センシングタンパク質によって受信され、JA生合成8,9を含む下流の防御シグナル伝達経路の活性化につながる。植物創傷応答におけるCa2+信号の重要性を支持する多数のそのような報告にもかかわらず、創傷によって誘発されるCa2+信号の空間的および時間的特性に関する情報は限られている。
遺伝的にコードされたCa2+指標を用いたリアルタイムイメージングは、Ca2+信号の空間的および時間的ダイナミクスを監視し、定量化するための強力なツールです。現在までに、このようなセンサーのバージョンは、単一の細胞のレベルでCa2+信号の可視化を可能にする開発された、組織、臓器、さらには植物全体10に。植物に使用されるCa2+の最初の遺伝子組み換えバイオセンサーは、クラゲエーコレアビクトリア11に由来する生物発光タンパク質aequorinであった。 この化学発光タンパク質は、植物12、13、13、14、15、16、17、18の様々なストレスに応じてCa2+の変化を検出するために使用されていますが、非常に低い発光シグナルのためにリアルタイムイメージングには適していません。黄色のカメレオンのようなフェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)ベースのCa2+指標は、植物19、20、21、22、23、24におけるCa2+シグナル伝達事象の範囲のダイナミクスを調査するためにも成功して使用されています。これらのセンサは、イメージングアプローチと互換性があり、最も一般的には、カ2+結合タンパク質カルモジュリン(CaM)とミオシン軽鎖キナーゼからのCaM結合ペプチド(M13)で構成され、いずれも2つのフルオロフォアタンパク質の間で融合され、一般的にはシアン蛍光タンパク質(CFP)と黄色蛍光タンパク質(YFP)10である。CaMへのCa2+結合はセンサーの立体構造変化をもたらすCaMとM13の間の相互作用を促進する。この変化は、CFPとYFP間のエネルギー伝達を促進し、CFPからの蛍光放射を減少させながらYFPの蛍光強度を増加させる。CFPからYFP蛍光へのこのシフトを監視すると、Ca2+レベルの増加の尺度が提供されます。これらのFRETセンサーに加えて、GCaMPやR-GECOなどの単一蛍光タンパク質(FP)ベースのCa2+バイオセンサーは、植物イメージングアプローチと互換性があり、高感度と使いやすさ25、26、27、28、29、30によるcyt変化の研究に広く使用されています。GCAMPは、単一の円形に分通(cp)GFPを含み、再度CaMとM13ペプチドと融合する。CaMとM13の間のCa2+依存的相互作用は、cpGFPのプロトネーション状態の変化を促進するセンサーの立体構造変化を引き起こし、その蛍光シグナルを増強する。従って、Ca2+レベルが上昇するにつれて、cpGFP信号は増加する。
機械的な傷や草食に応答して発生するCa2+シグナルのダイナミクスを調べるには、GCaMP変異体を発現するトランスジェニックなシロイナナ植物、GCaMP3、および広視野蛍光顕微鏡6を用いた。このアプローチは、葉の創傷部位から植物全体への長距離Ca2+信号の迅速な伝達を視覚化することに成功した。したがって、創傷部位で[Ca2+]cytの増加がすぐに検出されたが、このCa2+信号は、創傷の数分以内に血管系を通って隣接する葉に伝播した。さらに、この急速な全身創傷シグナルの伝達が、2つのグルタミン酸受容体様遺伝子、グルタミン酸受容体様(GLR)、GLR3.3、GLR3.66の変異を有するシロイヌズナシス植物において消滅することを発見した。 GLRsは、創傷応答3、花粉管成長31、根発発生32、寒冷応答33、および自然免疫34を含む多様な生理学的プロセスに関与するアミノ酸ゲートCa2+チャネルとして機能するように見える。このよく理解されているにもかかわらず、GLRsの広範な生理学的機能、それらのリガンド特異性、イオン選択性、および細胞内局在性などのそれらの機能特性に関する情報は、35に制限されている。しかし、最近の研究では、GLR3.3とGLR3.6がそれぞれフロレムとキシレムに局在していると報告されています。植物GLRsは、哺乳動物におけるヨノトロピックグルタミン酸受容体(iGluRs)36と類似しており、哺乳類神経系37におけるグルタミン酸、グリシン、およびDセリンなどのアミノ酸によって活性化される。実際に、創傷部位における100mMグルタミン酸の適用は、他のアミノ酸ではなく、シロイヌナズナでの高速の長距離Ca2+シグナルを誘導することを実証した。この応答は、グルタミン酸がこれらの受容体様チャネルの一方または両方を介して作用し得ることを示唆するglr3.3/glr3.6突然変異体において廃止され、実際に、AtGLR3.6は、これらのレベルのグルタミン酸38によってゲート化されるのが最近示された。
植物では、構造アミノ酸としての役割に加えて、グルタミン酸は主要な発達レギュレータ39として提案されている。しかし、その空間的および時間的なダイナミクスは十分に理解されていません。Ca2+と同様に、グルタミン酸に対する遺伝的にコード化された指標は、生細胞40, 41におけるこのアミノ酸のダイナミクスを監視するために開発されています。iGluSnFRは、エシェリヒア・コリ42,43由来のcpGFPおよびグルタミン酸結合タンパク質(GltI)で構成されるGFPベースのシングルFPグルタミン酸バイオセンサである。グルタミン酸結合によってGltIに誘導されるiGluSnFRの立体構造変化により、GFP蛍光発光が増強される。細胞外グルタミン酸が植物創傷応答においてシグナル伝達分子として働くかどうかを調べるため、iGluSnFR配列を基本的なキチナーゼシグナルペプチド分泌配列(CHIB-iGluSnFR)と結合し、このバイオセンサを再生不良空間6に局地化した。このアプローチにより、このセンサを発現するトランスジェニックなシロイヌナズナシス植物を用いた、無形成グルタミン酸濃度([Glu]apo)の変化を画像化することができました。創傷部位でのiGluSnFRシグナルの急激な増加を検出した。このデータは、グルタミン酸が損傷した細胞/組織から創傷時にアポプラストに漏れ出し、GLRsを活性化し、植物6における長距離Ca2+信号につながる損傷信号として作用するという考えを支持する。
ここでは、傷6に応答して長距離Ca2+ および細胞外グルタミン酸シグナルのダイナミクスを監視および分析するために、遺伝的にコードされたバイオセンサーを用いた植物全体のリアルタイムイメージング方法について述べている。遺伝子組み換えバイオセンサーを発現する広視野蛍光顕微鏡およびトランスジェニック植物の利用可能性は、Ca2+ 波などの高速に伝達された長距離信号を検出するための強力で簡単に実装されたアプローチを提供します。
全身シグナル伝達は、植物が局所的な外部環境刺激に応答し、その後、植物全体のレベルで恒常性を維持するために重要です。動物のような高度な神経系は装備されていないが、移動式電気信号(そしておそらく油圧)信号やROSとCa2+46、47の波を伝播するなどの要因に基づいて、臓器内および器官間の迅速なコミュニケーションを採用している。</…
The authors have nothing to disclose.
この研究は、日本科学振興協会(17H05007および18H05491)からMT、国立科学財団(IOS1557899およびMCB2016177)および米国航空宇宙局(NNX14AT25Gおよび80NSSC19K0126)からのSGへの助成金によって支えられました。
Arabidopsis expressing GCaMP3 | Saitama University | ||
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR | Saitama University | ||
GraphPad Prism 7 | GraphPad Software | ||
L-Glutamate | FUJIFILM Wako | 072-00501 | Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH]. |
Microsoft Excel | Microsoft Corporation | ||
Murashige and Skoog (MS) medium | FUJIFILM Wako | 392-00591 | composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH. |
Nikon SMZ25 stereomicroscope | Nikon | ||
NIS-Elements AR analysis | Nikon | ||
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO) | Nikon | ||
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2) | Hamamatsu Photonics | C11440-22CU | |
Square plastic Petri dish | Simport | D210-16 |