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생물학

아라비도시스에서 지역 및 전신 상처 신호의 넓은 필드, 실시간 이미징

Published: June 04, 2021
doi:
10.3791/62114
, , , ,
1Department of Biochemistry and Molecular Biology,Saitama University, 2Department of Botany,University of Wisconsin

Summary

세포외 글루타메이트 트리거 전신 칼슘 신호는 식물의 기계적 상처 및 초식 공격에 대한 식물 방어 대응의 유도에 매우 중요합니다. 이 문서에서는 칼슘과 글루타민염에 민감한 형광 바이오 센서를 표현하는 아라비도시스 탈리아나 식물을 사용하여 이러한 두 요인의 공간 적 및 측두동을 시각화하는 방법을 설명합니다.

Abstract

식물은 손상된 부품과 손상되지 않은 부품 모두에서 방어 반응을 유도하여 상처및 허브아이보리와 같은 기계적 응력에 반응합니다. 잎이 감기 시, 세포색 칼슘 이온 농도의 증가 (Ca2+ 신호) 상처 부위에서 발생. 이 신호는 방어 응답이 활성화되는 손상되지 않은 나뭇잎으로 빠르게 전송됩니다. 우리의 최근 연구는 그(것)들의 주위에 apoplast로 잎의 부상당한 세포에서 누설하는 글루타민이 상처 신호 역할을 한다는 것을 밝혔습니다. 이 글루타민은 글루타민산 수용체와 같은 Ca2+ 투과성 채널을 활성화하여 공장 전체에서 장거리 Ca2+ 신호 전파로 이어집니다. 이러한 이벤트의 공간적 및 현세적 특성은 유전적으로 인코딩된 형광 바이오 센서를 표현하는 살아있는 식물의 실시간 이미징으로 캡처할 수 있습니다. 여기서 우리는 상처에 대응하여 발생하는 아포가소성 글루타민의 Ca2+ 신호 및 변경의 역학을 모니터링하는 식물 전체의 실시간 이미징 방법을 소개합니다. 이 접근법은 광야 형광 현미경 및 녹색 형광 단백질 (GFP)기반Ca2+ 및 글루타민산 바이오 센서를 표현하는 형질 전환 성 애기장 식물을 사용합니다. 또한, 우리는 쉽게 상처 유도, 글루타민시 트리거 빠른 장거리 Ca2 + 신호 전파를 유도하는 방법론을 제시한다. 이 프로토콜은 또한 공장 시스템 신호가 신호 및 응답 네트워크에 어떻게 관여할 수 있는지 조사하는 데 도움이 되는 다른 플랜트 스트레스에 대한 연구에 적용할 수 있습니다.

Introduction

식물은 생물학적 스트레스, 예를 들어 곤충이 먹이를 주는 것에서 벗어날 수 없으므로 정교한 응력 감지 및 신호 변환 시스템을 진화하여 허브 리보리1과같은 문제로부터 자신을 감지하고 보호합니다. 상처 나 초식 포동 공격에 따라 식물은 부상당한 부위뿐만 아니라 손상되지 않은 탈설 기관2에서식물 호르몬 자스모산 (JA)의 축적을 포함한 신속한 방어 반응을 시작합니다. 이 JA는 둘 다 직접 손상된 조직에서 방어 반응을 유발하고 공장의 손상되지 않은 부분에서 방어를 선제적으로 유도합니다. 애기독증에서,상처에 의해 유도된 JA의 축적은 식물내 다른 곳에서 손상된 단 몇 분 이내에 손상된 단 몇 분 이내에 손상된 잎에서 검출되었다3. Ca2+,반응성 산소 종(ROS) 및 전기 신호와 같은 여러 후보는 식물4,5에서이러한 장거리 상처 신호로 작용하도록 제안되었습니다.

Ca2+는 진핵 생물에서 가장 다재다능하고 유비쿼터스 두 번째 메신저 요소 중 하나입니다. 식물에서, 애벌레 츄잉 및 기계적 상처는 분광성 Ca2+ 농도 ([Ca2+]cyt)의급격한 증가를 일으키는 원인이 되며, 모두 상처 입은 잎과 상처가 없는 먼 잎6,7. 이러한 전신 Ca2+ 신호는 세포내 Ca2+-센싱 단백질에 의해 수신되며, 이는 JA 생합성8,9를포함한 다운스트림 방어 신호 경로의 활성화로 이어진다. 식물 상처 반응에서 Ca2+ 신호의 중요성을 뒷받침하는 수많은 보고서에도 불구하고 상처로 유도된 Ca2+ 신호의 공간 및 측두적인 특성에 대한 정보는 제한적입니다.

유전자 인코딩 된 Ca2+ 지표를 사용하여 실시간 이미징은 Ca2+ 신호의 공간 및 시간 역학을 모니터링하고 정량화하는 강력한 도구입니다. 현재까지 단일 셀 수준에서 조직, 장기 및 전체식물(10)까지Ca2+ 신호를 시각화할 수 있도록 이러한 센서의 버전이 개발되었습니다. 식물에 사용되는 Ca2+를 위한 최초의 유전자 인코딩 된 바이오 센서는 해파리 Aequorea 빅토리아11에서파생 된 생물 발광 단백질 aequorin이었다. 이러한 화학발광 단백질은 식물12,13,14, 15,16,17,18의다양한 응력에 대한 반응으로 Ca2+ 변화를 검출하는 데 사용되었지만, 발광 신호가 매우 낮기 때문에 실시간 이미징에 적합하지 않다. Förster 공명 에너지 전송 (FRET)기반 Ca2+ 지표, 황 낙타와 같은, 또한 성공적으로 식물19, 20,21,22,23,24에서Ca 2 + 신호 이벤트의 범위의 역학을 조사하는 데 사용되었습니다. 이러한 센서는 이미징 접근법과 호환되며 가장 일반적으로 근산광사슬 키나아제에서 Ca2+ 결합 단백질 칼모둘린(CaM)과 CaM 결합 펩타이드(M13)로 구성되며, 모두 두 개의 형광단백질, 일반적으로 시안 형광단백질(CFP) 및 황형광 단백질(YFP)으로 구성된다. Ca2+ CaM에 바인딩하는 CaM과 M13 간의 상호 작용을 촉진하여 센서의 변형 변화를 촉진합니다. 이러한 변화는 CFP와 YFP 간의 에너지 전달을 촉진하여 YFP의 형광 강도를 증가시키면서 CFP에서 형광 방출을 감소시킵니다. CFP에서 YFP 형광으로의 이러한 변화를 모니터링하면 Ca2+ 수준의 증가를 측정합니다. 이러한 FRET 센서 외에도, 단일 형광 단백질(FP)기반 Ca2+ 바이오 센서(GCaMP 및 R-GECO와 같은)도 식물 이미징 접근법과 호환되며, 높은 감도 및 사용 편의성25,26,27,28,29,30을연구하는 데 널리 사용된다. GCaMpPs는 단일 원형 변록(cp) GFP를 함유하고 있으며, 다시 CaM 및 M13 펩타이드에 융합된다. Ca2+-C13 간의 의존적 상호 작용은 cpGFP의 프로토네이션 상태의 변화를 촉진하는 센서의 변형 변화를 일으켜 형광 신호를 강화합니다. 따라서 Ca2+ 레벨이 상승함에 따라 cpGFP 신호가 증가합니다.

기계적 상처 또는 초식동물 공급에 대응하여 생성된 Ca2+ 신호의 역학을 조사하기 위해, 우리는 GCaMP 변종, GCaMP3 및 광야 형광 현미경 6을 표현하는 형질 아기장 염 탈리아나 식물을사용했습니다. 이 방법은 잎에 상처 부위에서 전체 식물에 장거리 Ca2 + 신호의 신속한 전송을 시각화하는 데 성공했습니다. 따라서 상처 부위에서 [Ca2+]cyt의 증가가 즉시 감지되었지만 이 Ca2+ 신호는 상처후 몇 분 이내에 혈관을 통해 이웃 잎에 전파되었다. 더욱이, 우리는 이 급속한 전신 상처 신호의 전송이 2개의 글루타민산 수용체 같이 유전자, 글루타민산 수용체 같이(GLR), GLR3.3 및 GLR3.6에서돌연변이를 가진 아라비도시스 식물에서 폐지된다는 것을 것을을 발견했습니다. GlR은 상처 반응3,꽃가루 튜브 성장31,근간 작용32,감기 반응33,선천성 면역34를포함한 다양한 생리적 과정에 관여하는 아미노산 게이트 Ca2+ 채널로 기능하는 것으로 보인다. 이러한 잘 이해되고 광범위한 GlR의 광범위한 생리적 기능에도 불구하고, 리간 특이성, 이온 선택성 및 세포외 국소화와 같은 기능적 특성에 대한 정보는35에한정된다. 그러나, 최근 연구는 GLR3.3 및 GLR3.6 phloem와 자일렘에 국한되는 것을 각각 보고했습니다. 식물 GLR은 포유류에서 요노소글루타민체 수용체(iGluRs)36과 유사하며, 포유동물 신경계에서 글루타민트, 글리신 및 D-세린과 같은 아미노산에 의해활성화된다37. 실제로, 우리는 상처 부위에서 100 mM 글루타민산의 적용이 아라비도프시스에서신속하고 장거리 Ca2+ 신호를 유도한다는 것을 보여주었으며, 이는 세포외 글루타민산염이 식물6에서상처 신호로 작용할 가능성이 있음을 나타낸다. 이러한 반응은 글루타민이 이러한 수용체와 같은 채널 중 하나 또는 둘 다를 통해 작용할 수 있음을 시사하는glr3.3/glr3.6 돌연변이체에서 폐지되며, AtGLR3.6은 최근 이러한 글루타메이트(38)의 수준에 의해 문이 있는 것으로 나타났다.

식물에서는, 구조 아미노산으로서의 역할 외에도 글루타민산은 또한 주요 발달레귤레이터(39)로제안되었다. 그러나, 그것의 공간 및 시간 역학 제대로 이해. Ca2+마찬가지로, 글루타민에 대한 여러 유전자 인코딩 된 지표는 살아있는세포40,41에서이아미노산의 역학을 모니터링하기 위해 개발되었습니다. iGluSnFR은 에슈리치아 대장균42,43로부터cpGFP 및 글루타메이트 결합 단백질(GltI)으로 구성된 GFP 기반 단일 FP 글루타민산 바이오센서이다. GltI에 결합하는 글루타메이트에 의해 유도되는 iGluSnFR의 변형 변화는 향상된 GFP 형광 방출을 초래합니다. 세포외 글루타민이 식물 상처 반응에서 신호 분자역할을 하는지 여부를 조사하기 위해 iGluSnFR 서열을 기본 치티나아제 신호 펩타이드 분비 서열(CHIB-iGluSnFR)과 연결하여 이 바이오센서를 아포가성공간에서국소화하였다 6. 이 접근법은 이 센서를 표현하는 형질전환 아라비도시스 식물을 사용하여 종말성 글루타민염 농도([Glu]apo)의변화에 대한 이미징을 가능하게 했습니다. 우리는 상처 부위에서 iGluSnFR 신호의 급속한 증가를 감지했습니다. 이 데이터는 글루타민트가 손상된 세포/조직에서 상처시 아포라스트로 누출되고 GlR을 활성화하고 식물6에서장거리 Ca2+ 신호로 이어지는 손상 신호역할을 한다는 생각을 뒷받침한다.

여기서, 우리는 유전자 로코딩된 바이오 센서를 사용하여 식물 전체의 실시간 이미징 방법을 설명하여 상처6에대한 응답으로 장거리 Ca2+ 및 세포외 글루타민트 신호의 역학을 모니터링하고 분석한다. 유전자 인코딩 된 바이오 센서를 표현하는 광장 형광 현미경 및 형질 형질 검사기및 형질 검사기의 가용성은 Ca2+ 파도와 같이 빠르게 전송되는 장거리 신호를 감지하는 강력하고 쉽게 구현 된 접근 방식을 제공합니다.

Protocol

1. 식물 재료 준비 1.5mL 마이크로튜브에서 표면은 GCaMP3 또는 CHIB-iGluSnFR을 3분 동안 20%(v/v) NaClO로 흔들어 서 아기방시스 탈리아나(Col-0 accession) 식물의 씨앗을 살균한 다음 멸균 증류수로 5회 세척합니다.참고: GCaMP3 또는 CHIB-iGluSnFR을 표현하는 애기장염의 형질전환선은 이전에설명되었습니다 6. 멸균 후드에 30mL 멸균(autoclaved) 무라시게와 스쿠그(MS) 매?…

Representative Results

[Ca2+]시동및 【글루】아포의 신호 전파는 도 3, 도 4, 무비 S1및 영화 S2에제시된다. GCaMP3(0s)를 발현하는 식물에서 잎 1의 잎 1을 절단하면 혈관 (40 s)을 통해 로컬로 빠르게 유도된 [Ca2+]시트의 상당한 증가를 주도하였다(도3 및 무비 S1).<…

Discussion

발전소는 지역화된 외부 환경 자극에 대응한 다음 전체 식물 수준에서 항상성을 유지하는 데 중요합니다. 동물과 같은 첨단 신경계를 장착하지는 않지만, 이동식 전기(및 유압) 신호및 ROS 와 Ca2+46,47의전파와 같은 요인에 따라 기관 안팎에서 신속한 통신을 사용합니다. 위에서 설명한 프로토콜은 상처에 대한 응답으로 Ca2+ 및 아포가소성…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 일본과학진흥협회(17H05007 및 18H05491)에서 MT, 국립과학재단(IOS1557899, MCB20161777) 및 국립항공우주청(NNX14AT25G 및 80NSSSCC191K19)에 보조금을 지원했다.

Materials

Arabidopsis expressing GCaMP3 Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR Saitama University
GraphPad Prism 7 GraphPad Software
L-Glutamate FUJIFILM Wako 072-00501 Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium FUJIFILM Wako 392-00591 composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope Nikon
NIS-Elements AR analysis Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO) Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2) Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Square plastic Petri dish Simport D210-16
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References

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Keywords: Real-time ImagingPlant Systemic SignalingCalciumApoplastic GlutamateWound ResponseBiotic And Abiotic StressFluorescence MicroscopyArabidopsis
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Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y., Gilroy, S., Toyota, M. Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (172), e62114, doi:10.3791/62114 (2021).
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