तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में अंतर्जात Monoamine रिलीज के माप के लिए एक प्लेट आधारित परख
Summary
यह विधि तीव्र मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग करके अंतर्जात मोनोमाइन रिलीज का पता लगाने के लिए एक सरल तकनीक का परिचय देती है। सेटअप मोनोमाइन रिलीज के लिए एक ऊतक धारक युक्त एक 48-अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग करता है। जारी मोनोमाइन का विश्लेषण HPLC द्वारा इलेक्ट्रोकेमिकल डिटेक्शन के साथ युग्मित किया जाता है। इसके अतिरिक्त, यह तकनीक दवा की खोज के लिए एक स्क्रीनिंग विधि प्रदान करती है।
Abstract
मोनोमाइन न्यूरोट्रांसमीटर कई न्यूरोलॉजिकल और मनोवैज्ञानिक बीमारियों से जुड़े हुए हैं। इस तरह की स्थितियों के पशु मॉडल ने मोनोमाइन न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज और अपटेक गतिशीलता में परिवर्तन दिखाया है। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, फास्ट स्कैन चक्रीय वोल्टमेट्री (एफएससीवी), इमेजिंग, विवो माइक्रोडायलिसिस, ऑप्टोजेनेटिक्स, या रेडियोधर्मिता के उपयोग जैसे तकनीकी रूप से जटिल तरीकों को मोनोमाइन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है। यहां प्रस्तुत विधि मोनोमाइन रिलीज की जांच के लिए ऊतक धारकों वाले 48-अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग करके तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में मोनोमाइन रिलीज का पता लगाने के लिए एक अनुकूलित दो-चरणीय दृष्टिकोण है, और मोनोमाइन रिलीज माप के लिए इलेक्ट्रोकेमिकल डिटेक्शन (एचपीएलसी-ईसीडी) के साथ मिलकर उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी। संक्षेप में, प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स, हिप्पोकैम्पस और पृष्ठीय स्ट्रिएटम सहित रुचि के क्षेत्रों वाले चूहे के मस्तिष्क वर्गों को ऊतक स्लाइसर या वाइब्रेटोम का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। ब्याज के इन क्षेत्रों को पूरे मस्तिष्क से विच्छेदित किया गया था और एक ऑक्सीजन युक्त शारीरिक बफर में इनक्यूबेट किया गया था। व्यवहार्यता प्रयोगात्मक समय पाठ्यक्रम भर में जांच की गई थी, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड (एमटीटी) परख द्वारा. तीव्र रूप से विच्छेदित मस्तिष्क क्षेत्रों को अलग-अलग दवा की स्थितियों में इनक्यूबेट किया गया था जो ट्रांसपोर्टर (एम्फ़ैटेमिन) के माध्यम से या एक्सोसाइटोटिक वेसिकुलर रिलीज (केसीएल) के सक्रियण के माध्यम से मोनोमाइन रिलीज को प्रेरित करने के लिए जाने जाते हैं। इनक्यूबेशन बाद, supernatant में जारी उत्पादों को एकत्र किया गया और एक HPLC-ECD प्रणाली के माध्यम से विश्लेषण किया गया। यहां, बेसल मोनोमाइन रिलीज तीव्र मस्तिष्क स्लाइस से एचपीएलसी द्वारा पता लगाया जाता है। यह डेटा विवो और इन विट्रो परिणामों में पिछले का समर्थन करता है जो दिखाता है कि AMPH और KCl मोनोमाइन रिलीज को प्रेरित करते हैं। यह विधि मोनोमाइन ट्रांसपोर्टर-निर्भर रिलीज से जुड़े तंत्र का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है और तेजी से और कम लागत वाले तरीके से मोनोमाइन रिलीज को प्रभावित करने वाले यौगिकों को स्क्रीन करने का अवसर प्रदान करती है।
Introduction
न्यूरोलॉजिकल और मनोवैज्ञानिक रोगों की एक बहुतायत मोनोमाइन न्यूरोट्रांसमीटर (डोपामाइन [डीए], सेरोटोनिन [5-एचटी], नॉरपेनेफ्रिन [एनई]) होमियोस्टैसिस 1,2,3 के असंतुलन या अपर्याप्त रखरखाव से जुड़ी हुई है। इन स्थितियों में शामिल हैं, लेकिन अवसाद 1,2, सिज़ोफ्रेनिया 2, चिंता 2, लत 4, रजोनिवृत्ति 5,6,7, दर्द 8, और पार्किंसंस रोग 3 तक सीमित नहीं हैं। उदाहरण के लिए, रजोनिवृत्ति के कई चूहे मॉडलों से पता चला है कि हिप्पोकैम्पस, प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स और स्ट्रिएटम के भीतर मोनोमाइन की विकृति या कमी अवसाद और संज्ञानात्मक गिरावट दोनों से जुड़ी हो सकती है, जो रजोनिवृत्ति का अनुभव करने वाली महिलाओं में देखी जाती है। इन मॉडलों में मोनोमाइन्स के विनियमन की बड़े पैमाने पर एचपीएलसी-ईसीडी का उपयोग करके जांच की गई है, हालांकि अध्ययनों ने मापा न्यूरोट्रांसमीटर सामग्री बनाम न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज 5,6,7 के बीच भेदभाव नहीं किया है। Monoamines शास्त्रीय रूप से Ca2 + – निर्भर vesicular release9 के माध्यम से extracellular अंतरिक्ष में जारी कर रहे हैं, और उनके संबंधित प्लाज्मा झिल्ली पुन: अपटेक प्रणाली (डोपामाइन ट्रांसपोर्टर, DAT; सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर, SERT; नॉरपेनेफ्रिन ट्रांसपोर्टर, नेट) 10,11 के माध्यम से वापस पुनर्नवीनीकरण कर रहे हैं। इसके विपरीत, डेटा से पता चलता है कि ये ट्रांसपोर्टर मोनोमाइन को जारी करने या एफीलैक्स करने में सक्षम हैं, क्योंकि एम्फ़ैटेमिन (एएमपीएच) और 3,4-मेथिलेनेडियोक्सीमेथेमफेटामाइन (एमडीएमए) जैसे दुरुपयोग की दवाओं को क्रमशः डीए और 5-एचटी जारी करने के लिए जाना जाता है, क्रमशः उनके ट्रांसपोर्टर सिस्टम 12,13,14,15,16,17 के माध्यम से। . इस प्रकार, मोनोमाइन रिलीज गतिशीलता की एक उचित यांत्रिक समझ विशिष्ट और लक्षित फार्माकोथेरेपी विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है।
तकनीकों की एक विस्तृत श्रृंखला को मोनोमाइन रिलीज का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है जैसे फास्ट स्कैन चक्रीय वोल्टमेट्री (एफएससीवी) 18, विवो माइक्रोडायलिसिस 13, इमेजिंग 19, रेडियोलेबल मोनोमाइन्स 20 के साथ प्रीइनक्यूबेशन, ऑप्टोजेनेटिक्स, और हाल ही में, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट सेंसर और फोटोमेट्री 21,22 . एफएससीवी और विवो माइक्रोडायलिसिस में मोनोमाइन रिलीज का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्राथमिक तकनीकें हैं। FSCV का उपयोग मुख्य रूप से तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में और vivo23 में डीए के उत्तेजित एक्सोसाइटोटिक रिलीज का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। क्योंकि FSCV इलेक्ट्रोड का उपयोग करने के लिए उत्तेजित या रिलीज पैदा करता है, न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज का प्राथमिक स्रोत Ca2 + निर्भर vesicular रिलीज 18,24,25,26,27,28,29,30,31 है . विवो माइक्रोडायलिसिस में एचपीएलसी के साथ मिलकर ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र में रखी गई जांच का उपयोग करके एक्स्ट्रासेल्युलर न्यूरोट्रांसमीटर के स्तर में परिवर्तन को मापता है13,32। एफएससीवी के समान, विवो माइक्रोडायलिसिस में एक प्रमुख सीमा न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज के स्रोत को निर्धारित करने में कठिनाई है: Ca2 + निर्भर वेसिकुलर रिलीज या ट्रांसपोर्टर निर्भर। उल्लेखनीय है, दोनों विधियां मोनोमाइन रिलीज के प्रत्यक्ष माप के लिए अनुमति देती हैं। ऑप्टोजेनेटिक्स की हालिया प्रगति के माध्यम से, अनुसंधान उत्कृष्ट सेल-प्रकार की विशिष्टता 21,22 के साथ एक छोटे से समय में 5-एचटी और डीए रिलीज का पता लगाने का प्रदर्शन करता है। हालांकि, इन रणनीतियों को जटिल और महंगी तकनीकों और उपकरणों की आवश्यकता होती है, और अप्रत्यक्ष रूप से मोनोमाइन रिलीज को मापते हैं, विशेष रूप से रिसेप्टर्स के लिए मोनोमाइन बाइंडिंग के माध्यम से। इसके अलावा, रेडियोलेबल मोनोमाइन का उपयोग मोनोमाइन गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए भी किया जाता है। रेडियोलेबल मोनोमाइन को विभिन्न मॉडल प्रणालियों में प्रीलोडेड किया जा सकता है जैसे कि हेटरोलॉगस कोशिकाएं प्रत्येक मोनोमाइन ट्रांसपोर्टर 20,33,34,35,36,37,38,39,40, प्राथमिक न्यूरॉन्स 20, synaptosomes33,39,41, 42, और तीव्र मस्तिष्क स्लाइस43,44। हालांकि, रेडियोधर्मिता प्रयोगकर्ता को संभावित नुकसान पहुंचाती है, और ट्रिटियम-लेबल वाले एनालिस्ट्स अंतर्जात मोनोमाइन गतिशीलता 45,46 को ईमानदारी से पुनरावृत्ति नहीं कर सकते हैं। HPLC-ECD जैसे ऑफ-लाइन डिटेक्शन विधियों के साथ संयुक्त सुपरफ्यूजन सिस्टम ने कई ऊतक स्रोतों से मोनोमाइन का पता लगाने की अनुमति दी है। यहां, यह प्रोटोकॉल सीधे अंतर्जात बेसल और उत्तेजित मोनोमाइन रिलीज को मापने के लिए तीव्र मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग करके एक अनुकूलित और कम लागत, सरल और सटीक विधि के रूप में प्रदान करता है।
तीव्र मस्तिष्क स्लाइस यंत्रवत परिकल्पनाओं के परीक्षण के लिए अनुमति देते हैं, मुख्य रूप से क्योंकि वे विवो संरचनात्मक माइक्रोएन्वायरमेंट में संरक्षित करते हैं, और बरकरार synapses47,48,49,50,51,52 बनाए रखते हैं। कुछ अध्ययनों में, तीव्र मस्तिष्क स्लाइस या कटे हुए मस्तिष्क के ऊतकों का उपयोग केसीएल का उपयोग करके एक सुपरफ्यूजन तकनीक के साथ संयोजन के रूप में किया गया है ताकि Ca2 + मध्यस्थता रिलीज 53,54,55,56 को उत्तेजित किया जा सके। सुपरफ्यूजन सिस्टम न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज तंत्र के क्षेत्र की समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण रहा है, जिसमें मोनोमाइन भी शामिल हैं। हालांकि, ये प्रणालियां अपेक्षाकृत महंगी हैं, और ऊतक विश्लेषण के लिए उपलब्ध कक्षों की संख्या 4-12 तक है। इसकी तुलना में, यहां प्रस्तुत विधि सस्ती है, 48 ऊतक नमूनों के माप की अनुमति देती है, और 96 ऊतक नमूनों का उपयोग करने के लिए परिष्कृत किया जा सकता है। 48-अच्छी तरह से प्लेट के भीतर प्रत्येक अच्छी तरह से ऊतक धारक होते हैं जो ऊतक से जारी उत्पाद को अलग करने के लिए फिल्टर का उपयोग करते हैं, और जारी मोनोमाइन को फिर एचपीएलसी-ईसीडी द्वारा एकत्र और विश्लेषण किया जाता है। महत्वपूर्ण रूप से, यह विधि विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों जैसे प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स, हिप्पोकैम्पस और पृष्ठीय स्ट्रिएटम से 5-एचटी, डीए और एनई रिलीज के एक साथ माप की अनुमति देती है, जो औषधीय एजेंटों के साथ उपचार के बाद मोनोमाइन रिलीज को संशोधित करती है। इस प्रकार, प्रयोगकर्ता एक सस्ती बहु-अच्छी तरह से प्रणाली का उपयोग करके कई सवालों के जवाब दे सकता है जो परीक्षण किए गए नमूनों की संख्या को बढ़ाता है और इस प्रकार उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या को कम करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मोनोमाइन रिलीज माप कई प्रणालियों जैसे हेटरोलॉगस कोशिकाओं, न्यूरोनल संस्कृतियों, मस्तिष्क synaptosomes, पूर्व विवो तीव्र मस्तिष्क स्लाइस, और पूरे जानवरों में वर्षों से किया गया है13,20,41,42,58,64,65,66,67,68<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को अनुदान Fondecyt दीक्षा निधि एन जे.ए.पी. और एनआईएच अनुदान DA038598 को G.E.T. के लिए 11191049 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 48 Well plate | NA | NA | Assay |
| Acetonitrile | Fischer Scientific | A998-1 | Mobile Phase |
| Calcium Chloride Ahydrous | Sigma Aldrich | C1016 | Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer |
| Clarity Software | Anetc | ||
| Citric Acid | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 1002608421 | Dissection Buffer |
| DMF | Sigma Aldrich | D4551 | MTT Assay |
| EDTA-Na2 | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
| GraphPad Software | Graphpad Software, Inc | Statistical Analysis | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | Lysis buffer |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Lysis buffer |
| HPLC, Decade Amperometric | Anetc | HPLC, LC-EC system | |
| HPLC | Amuza | HPLC HTEC-510. | |
| L-Asrobic Acid | Sigma Aldrich | A5960 | Dissection Buffer |
| Magnesium Sulfate | Sigma | 7487-88-9 | KH Buffer |
| Microcentrifuge Filter Units UltraFree | Millipore | C7554 | Assay – 6 to fit in 48 well plate |
| MTT | Thermo Fisher | M6494 | MTT Assay |
| Nanosep | VWR | 29300-606 | Assay; protein assay |
| Octanesulfonic acid | Sigma Aldrich | V800010 | Mobile Phase |
| Pargyline Clorohydrate | Sigma Aldrich | P8013 | Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer |
| Phosphoric Acid | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
| Potassium Chloride | Sigma | 12636 | KH Buffer |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | 1001655559 | KH Buffer |
| Precisonary VF-21-0Z | Precissonary | Compresstome | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P2714 | Lysis buffer. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Dissection Buffer |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | Dissection Buffer |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | KH Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | Lysis buffer |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | MTT Assay / Lysis buffer |
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