सारकोमेरे फ्लोरोसेंट-टैग किए गए सारकोमेरे प्रोटीन का उपयोग करके प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का छोटा होना।
Summary
इस विधि का उपयोग फ्लोरोसेंट-टैग किए गए सारकोमेरे प्रोटीन के साथ प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग करके सारकोमेरे छोटा करने के लिए किया जा सकता है।
Abstract
Pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (पीएससी-सीएम) दोनों भ्रूण और प्रेरित pluripotent स्टेम (ES/iPS) कोशिकाओं से उत्पादित किया जा सकता है । ये कोशिकाएं हृदय रोग मॉडलिंग के लिए आशाजनक स्रोत प्रदान करती हैं। कार्डियोमायोपैथी के लिए, सारकोमेरे छोटा करना मानक शारीरिक आकलन में से एक है जिसका उपयोग वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स के साथ उनकी बीमारी फेनोटाइप की जांच करने के लिए किया जाता है। हालांकि, उपलब्ध तरीके पीएससी-सीएम की संकुचन का आकलन करने के लिए उपयुक्त नहीं हैं, क्योंकि इन कोशिकाओं ने अविकसित साकोमर हैं जो चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी के तहत अदृश्य हैं । इस मुद्दे को हल करने और पीएससी-सीएम के साथ सारकोमेरे छोटा करने के लिए, फ्लोरोसेंट-टैग किए गए सारकोमेरे प्रोटीन और फ्लोरोसेंट लाइव-इमेजिंग का उपयोग किया गया था। पतली जेड-लाइन और एक एम-लाइन क्रमशः दोनों सिरों और एक सारकोमेरे के केंद्र में रहते हैं। जेड-लाइन प्रोटीन-α-ऐक्टिनिन (ACTN2), Telethonin (TCAP), और ऐक्टिन से जुड़े लिम प्रोटीन (PDLIM3)-और एक एम लाइन प्रोटीन-Myomesin-2 (Myom2)-फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग किया गया । इन टैग किए गए प्रोटीन को एंडोजेनस एलील्स से नॉक-इन या एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) से व्यक्त किया जा सकता है। यहां, हम कार्डियोमायोसाइट्स के लिए माउस और मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं में अंतर करने के लिए, AAVs का उत्पादन करने के लिए, और प्रदर्शन और लाइव इमेजिंग का विश्लेषण करने के लिए तरीकों का परिचय । हम पीएससी-सीएम की एक पैटर्न वाली संस्कृति के लिए पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) टिकटों के उत्पादन के तरीकों का भी वर्णन करते हैं, जो फ्लोरोसेंट-टैग किए गए प्रोटीन के साथ सारकोमेरे छोटा करने के विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है। सारकोमेरे छोटा का आकलन करने के लिए, बीटिंग कोशिकाओं की समय-चूक छवियों को विद्युत उत्तेजना (0.5-1 हर्ट्ज) के तहत एक उच्च फ्रेमरेट (50-100 फ्रेम प्रति सेकंड) पर दर्ज किया गया था। सेल संकुचन के दौरान सारकोमेरे लंबाई का विश्लेषण करने के लिए, रिकॉर्ड किए गए समय-चूक छवियों को सारकोप्टिम के अधीन किया गया था, जो इमेजजे/फिजी के लिए प्लग-इन था। हमारी रणनीति पीएससी-सीएम में हृदय रोग फेनोटाइप की जांच के लिए एक सरल मंच प्रदान करती है।
Introduction
हृदय रोग दुनिया भर में मृत्यु का प्रमुख कारण हैं1 और कार्डियोमायोपैथी हृदय से संबंधित मौतों के तीसरे कारण का प्रतिनिधित्व करता है2। कार्डियोमायोपैथी रोगों का एक सामूहिक समूह है जो हृदय की मांसपेशियों को प्रभावित करता है। प्रेरित pluripotent स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं और कार्डियोमायोसाइट्स (पीएससी-सीएम) की ओर आईपीएस कोशिकाओं के निर्देशित-भेदभाव के हाल के घटनाक्रम कार्डियोमायोपैथी के एक इन विट्रो मॉडल के रूप में रोगी जीनोम के साथ कार्डियोमायोसाइट्स का अध्ययन करने के लिए दरवाजा खोला है । इन कोशिकाओं का उपयोग हृदय रोगों के रोगविज्ञान को समझने, उनके आणविक तंत्र को स्पष्ट करने और विभिन्न चिकित्सीयउम्मीदवारोंका परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। ब्याज की एक जबरदस्त राशि है, इस प्रकार, रोगी-व्युत्पन्न आईपीएस कोशिकाएं उत्पन्न की गई हैं (उदाहरण के लिए, हाइपरट्रोफिक कार्डियोमायोपैथी [एचसीएम]4,5,अतालताजनक सही वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोपैथी [एआरवीसी]6,डिलेटेड कार्डियोमायोपैथी [डीसीएम]7,और माइटोकॉन्ड्रियल-कार्डियो से संबंधित क्योंकि कार्डियोमायोपैथी की विशेषताओं में से एक सारकोमर की शिथिलता और व्यवधान है, एक वैध उपकरण जो समान रूप से सारकोमेरे कार्य को मापता है।
सारकोमेरे छोटा सारकोमेरे फ़ंक्शन और पशु मॉडल और मनुष्यों से प्राप्त वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स की संकुचन का आकलन करने के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है। सरकोमरे को छोटा करने के लिए, चरण-विपरीत के तहत दिखाई देने वाले अच्छी तरह से विकसित सारकोमों की आवश्यकता होती है। हालांकि, पीएससी-सीएम ने विट्रो डिस्प्ले में सुसंस्कृत अविकसित और अव्यवस्थित सारकोमर और इसलिए,10को छोटा करने के लिए सारकोमर को ठीक से मापने के लिए उपयोग करने में असमर्थ हैं। पीएससी-सीएम की संकुचनता का ठीक से आकलन करने में यह कठिनाई विट्रो मेंहृदय कार्यों का आकलन करने के लिए एक मंच के रूप में उनके उपयोग में बाधा डालती है । पीएससी-सीएम की अनुबंध अप्रत्यक्ष रूप से आकलन करने के लिए, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी, माइक्रो-पोस्ट सरणी, कर्षण बल माइक्रोस्कोपी, और बाधा माप का उपयोग इन कोशिकाओंद्वारा अपने परिवेश11, 12,13पर किए गए गति के प्रभाव को मापने के लिए किया गया है। वास्तविक सेलुलर मोशन (जैसे, सोनी से SI8000) की अधिक परिष्कृत और कम आक्रामक वीडियो-माइक्रोस्कोपी रिकॉर्डिंग का उपयोग वैकल्पिक रूप से उनकी संकुचन का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, हालांकि, यह विधि सीधे सारकोमेरे गति या बल पीढ़ी की गति14को मापने के लिए नहीं है।
पीएससी-सीएम में सारकोमेरे मोशन को सीधे तौर पर मापने के लिए, फ्लोरोसेंट-टैगिंग से लेकर सरकोमेरे प्रोटीन जैसे नए दृष्टिकोण उभर रहे हैं । उदाहरण के लिए, लाइफएक्ट का उपयोग सारकोमेरे मोशन15, 16को मापने के लिए फिलामेंटस ऐक्टिन (एफ-ऐक्टिन) को लेबल करने के लिए कियाजाताहै। आनुवांशिक रूप से संशोधित आईपीएस कोशिकाएं फ्लोरोसेंट प्रोटीन17, 18, 19द्वारा सारकोमेरे प्रोटीन (जैसे, α-ऐक्टिनिन [ACTN2] और मायोमसिन-2 [MYOM2]) को टैग करने के लिए एक और विकल्प हैं ।
इस पेपर में, हम वर्णन करते हैं कि Myom2-TagRFP (माउस भ्रूणीय स्टेम [ईएस] कोशिकाओं) और ACTN2-mCherry (मानव आईपीएस कोशिकाओं) का उपयोग करके सारकोमरे को छोटा करने के लिए समय-चूक इमेजिंग कैसे करें। हम यह भी बताते हैं कि एक नमूनों वाली संस्कृति सारकोमेरे संरेखण की सुविधा प्रदान करती है। इसके अलावा, हम एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) का उपयोग करके सारकोमेरे लेबलिंग की एक वैकल्पिक विधि का वर्णन करते हैं, जिसे रोगी-व्युत्पन्न आईपीएस कोशिकाओं पर व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
पीएससी-सीएम में हृदय रोग को मॉडल करने और दवाओं के प्रभावों को परखने के लिए इन विट्रो प्लेटफॉर्म के रूप में उपयोग करने की अपार संभावनाएं हैं । फिर भी, पीएससी-सीएम कार्यों का आकलन करने के लिए एक सटीक, एक…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम जिची मेडिकल यूनिवर्सिटी में रिजेनरेटिव मेडिसिन के डिवीजन में सभी लैब सदस्यों को सहायक चर्चा और तकनीकी सहायता के लिए स्वीकार करना चाहेंगे । इस अध्ययन को जापान एजेंसी फॉर मेडिकल रिसर्च एंड डेवलपमेंट (एएमईडी) के अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था; JP18bm0704012 और JP20bm0804018), विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी (JSPS; JP19KK0219), और जापानी परिसंचरण सोसायटी (बेसिक रिसर्च के लिए अनुदान) एचयू के लिए
Materials
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145-25 | |
| 2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer, | NOF Corp. | LIPIDURE-CM5206 | |
| 2-Propanol | Fujifilm wako | 166-04836 | |
| 35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high) | ibidi | 81156 | |
| AAVproR Helper Free System (AAV6) (vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector) |
Takara | 6651 | |
| ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs | N.A. | We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press) | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A18956-01 | |
| B27 supplement (50X), minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | |
| Benzonase (25 U/µL) | Merck Millipore | 70746 | |
| Blasticidin S Hydrochloride | Fujifilm wako | 029-18701 | |
| BMP-4, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 314-BP-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503-100g | |
| C59, Wnt Antagonist (WntC59) | abcam | ab142216 | |
| CAD drawing software, | Robert McNeel and Associates, WA, USA | Rhinoceros 6.0 | |
| Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20 | Sartorius | VS2042 | |
| CHIR99021 | Cayman | 13122 | |
| Chromium etchant | Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan | N14B | |
| Chromium mask coated with AZP1350 | Clean Surface Technology Co., Japan | CBL2506Bu-AZP | |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2)) | Takara | 9094 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose, without sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Ethanol (99.5) | Fujifilm wako | 057-00456 | |
| Fetal Bovine Serum | Moregate | 59301104 | |
| FGF-10, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 345-FG-025 | |
| Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant | Fujifilm wako | 060-04543 | |
| Gelatin from porcine skin powder | Sigma-Aldrich | G1890-100g | |
| Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154-500 | |
| GLASS BOTTOM culture plates | MatTek | P24G-1.5-13-F/H | |
| Ham’s F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11765-062 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440-061 | |
| L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Fujifilm wako | 196-01252 | |
| Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511) | Nippi | 892012 | |
| Mask aligner | Union Optical Co., Ltd., Japan | PEM-800 | |
| Maskless lithography tool | NanoSystem Solutions, Inc., Japan | D-Light DL-1000 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter) | Merck Millipore | SLHVR33RS | |
| Myom2-RFP (SMM18) | N.A. | Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020) | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Petri dish | Sansei medical co. Ltd | 01-004 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) | Nippon Gene | 311-90151 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer | Dow Corning Corp., MI, USA | SILPOT 184 | |
| polyethylenimine MAX (MW. 40,000) | Polyscience | 24765-1 | |
| Positive photoresist developer | Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan | NMD-3 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| Proteinase K | Takara | 9034 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Fujifilm wako | 166-23153 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein | R&D Systems, Inc. | 338-AC-050 | |
| Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express) | Thermo Fisher Scientific | 12604-039 | |
| RPMI1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Silicon wafer | Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan | N.A. | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| Spin-coater | Mikasa Co., Ltd., Japan | MS-A100 | |
| Spininng confocal microscopy | Oxford Instruments | Andor Dragonfly Spinning Disk System | |
| StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U) | Fujifilm wako | 195-16053 | |
| SU-8 3010 | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 3010 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 developer | |
| Tris-EDTA | Nippon Gene | 314-90021 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant | Fujifilm wako | 226-01781 |
References
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