Sarcómero acortamiento De Cardiomiocitos Derivados De Células Madre Pluripotentes Usando Proteínas De Sarcómero Marcado Con Fluorescentes.
Summary
Este método se puede utilizar para examinar el acortamiento del sarcómero usando cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes con proteínas de sarcómero marcadas con fluorescentes.
Abstract
Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes (PSC-CMs) se pueden producir a partir de células madre pluripotentes embrionarias e inducidas (ES/iPS). Estas células proporcionan fuentes prometedoras para el modelado de enfermedades cardíacas. Para las cardiomiopatías, el acortamiento del sarcómero es una de las evaluaciones fisiológicas estándar que se utilizan con los cardiomiocitos adultos para examinar sus fenotipos de enfermedad. Sin embargo, los métodos disponibles no son apropiados para evaluar la contractilidad de PSC-CMs, ya que estas células tienen sarcómeros subdesarrollados que son invisibles bajo microscopía de contraste de fase. Para dirigir este problema y para realizar el acortamiento del sarcómero con PSC-CMs, las proteínas fluorescente-marcadas con etiqueta y la vivo-proyección de imagen fluorescente fueron utilizadas. Las líneas Z delgadas y una línea M residen en ambos extremos y en el centro de un sarcómero, respectivamente. Las proteínas de la línea Z — α-Actinina (ACTN2), Telethonin (TCAP), y proteína LIM asociada a la actina (PDLIM3) — y una proteína de la M-línea — Myomesin-2 (Myom2) — fueron etiquetadas con las proteínas fluorescentes. Estas proteínas etiquetadas se pueden expresar a partir de alelos endógenos como knock-ins o de virus adenoasociados (AAVs). Aquí, presentamos los métodos para diferenciar las células madre pluripotentes de ratón y humanas a los cardiomiocitos, para producir AAVs, y para realizar y analizar imágenes en vivo. También se describen los métodos para la producción de polidimetilsiloxano (PDMS) sellos para un cultivo modelado de PSC-CMs, que facilita el análisis de acortamiento de sarcómero con proteínas marcadas con fluorescentes. Para evaluar el acortamiento del sarcómero, las imágenes del lapso de tiempo de las células que golpeaban fueron registradas en un alto framerate (50-100 cuadros por segundo) bajo estímulo eléctrico (0.5-1 hertzios). Para analizar la longitud del sarcómero en el curso de la contracción celular, las imágenes de lapso de tiempo grabadas se sometieron a SarcOptiM, un plug-in para ImageJ / Fiji. Nuestra estrategia proporciona una plataforma simple para investigar fenotipos de enfermedades cardíacas en PSC-CMs.
Introduction
Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de mortalidad a nivel mundial1 y la miocardiopatía representa la tercera causa de muertes relacionadas con el cardíaco2. La cardiomiopatía es un grupo colectivo de enfermedades que afectan a los músculos cardíacos. Los recientes desarrollos de células madre pluripotentes inducidas (iPS) y la diferenciación dirigida de las células iPS hacia cardiomiocitos (PSC-CMs) han abierto la puerta para el estudio de cardiomiocitos con genoma de pacientes como modelo in vitro de cardiomiopatía. Estas células pueden ser utilizadas para comprender la fisiopatología de las enfermedades cardíacas, para dilucidar sus mecanismos moleculares y para probar diferentes candidatos terapéuticos3. Existe una enorme cantidad de interés, por lo tanto, se han generado células iPS derivadas del paciente (por ejemplo, miocardiopatía hipertrófica [HCM]4,5,miocardiopatía arritmogénica del ventrículo derecho [ARVC]6,miocardiopatía dilatada [DCM]7y miocardiopatías relacionadas con las mitocondrias8,9). Debido a que una de las características de la cardiomiopatía es la disfunción y la interrupción de los sarcómeros, se necesita una herramienta válida que mida uniformemente la función del sarcómero.
El acortamiento de sarcómero es la técnica más utilizada para evaluar la función del sarcómero y la contractilidad de los cardiomiocitos adultos derivados de modelos animales y humanos. Para realizar el acortamiento del sarcómero, se requieren sarcómeros bien desarrollados que sean visibles bajo contraste de fase. Sin embargo, psc-CMs cultivados in vitro muestran sarcómeros subdesarrollados y desorganizados y, por lo tanto, no pueden ser utilizados para medir correctamente el acortamiento de sarcómero10. Esta dificultad para evaluar adecuadamente la contractilidad de PSC-CMs dificulta su uso como plataforma para evaluar las funciones cardíacas in vitro. Para evaluar indirectamente la contractilidad psc-cms, se han utilizado microscopía de fuerza atómica, matrices de micro-postes, microscopía de fuerza de tracción y mediciones de impedancia para medir los efectos del movimiento ejercido por estas células en sus alrededores11,12,13. Grabaciones de video microscopía más sofisticadas y menos invasivas del movimiento celular real (por ejemplo, SI8000 de SONY) se pueden utilizar para evaluar alternativamente su contractilidad, sin embargo, este método no mide directamente el movimiento del sarcómero o la cinética de generación de fuerza14.
Para medir directamente el movimiento del sarcómero en PSC-CMs, están surgiendo nuevos enfoques, como el etiquetado fluorescente de la proteína sarcómero. Por ejemplo, Lifeact se utiliza para etiquetar actina filamentosa (F-actina) para medir el movimiento del sarcómero15,16. Las células iPS modificadas genéticamente son otra opción para etiquetar proteínas de sarcómero (por ejemplo, α-actinina [ACTN2] y miomesina-2 [MYOM2]) por la proteína fluorescente17,18,19.
En este papel, describimos cómo realizar la proyección de imagen del lapso de tiempo para medir el acortamiento del sarcómero usando Myom2-TagRFP (células madre embrionarias del ratón [ES]) y ACTN2-mCherry (células humanas del iPS). También mostramos que un cultivo modelado facilita la alineación de sarcómeros. Además, describimos un método alternativo de etiquetado del sarcómero, usando los virus adeno-asociados (AAVs), que se pueden aplicar extensamente a las células paciente-derivadas del iPS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Psc-CMs tienen gran potencial para ser utilizado como una plataforma in vitro para modelar la enfermedad cardíaca y para probar los efectos de los fármacos. No obstante, primero debe establecerse un método preciso y unificado para evaluar las funciones de PSC-CMs. La mayoría de las pruebas funcionales funcionan con PSC-CMs, por ejemplo, electrofisiología, calcio transitorio y metabolismo26,y uno de los primeros estudios psc-cm derivados de pacientes fue sobre el síndrome de QT largo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a todos los miembros del laboratorio en la División de Medicina Regenerativa de la Universidad médica de Jichi por la útil discusión y asistencia técnica. Este estudio fue apoyado por las subvenciones de la Agencia Japonesa de Investigación y Desarrollo Médico (AMED; JP18bm0704012 y JP20bm0804018), la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS; JP19KK0219), y la Sociedad Japonesa de Circulación (la Subvención para la Investigación Básica) a H.U.
Materials
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145-25 | |
| 2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer, | NOF Corp. | LIPIDURE-CM5206 | |
| 2-Propanol | Fujifilm wako | 166-04836 | |
| 35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high) | ibidi | 81156 | |
| AAVproR Helper Free System (AAV6) (vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector) |
Takara | 6651 | |
| ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs | N.A. | We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press) | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A18956-01 | |
| B27 supplement (50X), minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | |
| Benzonase (25 U/µL) | Merck Millipore | 70746 | |
| Blasticidin S Hydrochloride | Fujifilm wako | 029-18701 | |
| BMP-4, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 314-BP-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503-100g | |
| C59, Wnt Antagonist (WntC59) | abcam | ab142216 | |
| CAD drawing software, | Robert McNeel and Associates, WA, USA | Rhinoceros 6.0 | |
| Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20 | Sartorius | VS2042 | |
| CHIR99021 | Cayman | 13122 | |
| Chromium etchant | Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan | N14B | |
| Chromium mask coated with AZP1350 | Clean Surface Technology Co., Japan | CBL2506Bu-AZP | |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2)) | Takara | 9094 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose, without sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Ethanol (99.5) | Fujifilm wako | 057-00456 | |
| Fetal Bovine Serum | Moregate | 59301104 | |
| FGF-10, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 345-FG-025 | |
| Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant | Fujifilm wako | 060-04543 | |
| Gelatin from porcine skin powder | Sigma-Aldrich | G1890-100g | |
| Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154-500 | |
| GLASS BOTTOM culture plates | MatTek | P24G-1.5-13-F/H | |
| Ham’s F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11765-062 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440-061 | |
| L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Fujifilm wako | 196-01252 | |
| Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511) | Nippi | 892012 | |
| Mask aligner | Union Optical Co., Ltd., Japan | PEM-800 | |
| Maskless lithography tool | NanoSystem Solutions, Inc., Japan | D-Light DL-1000 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter) | Merck Millipore | SLHVR33RS | |
| Myom2-RFP (SMM18) | N.A. | Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020) | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Petri dish | Sansei medical co. Ltd | 01-004 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) | Nippon Gene | 311-90151 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer | Dow Corning Corp., MI, USA | SILPOT 184 | |
| polyethylenimine MAX (MW. 40,000) | Polyscience | 24765-1 | |
| Positive photoresist developer | Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan | NMD-3 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| Proteinase K | Takara | 9034 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Fujifilm wako | 166-23153 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein | R&D Systems, Inc. | 338-AC-050 | |
| Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express) | Thermo Fisher Scientific | 12604-039 | |
| RPMI1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Silicon wafer | Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan | N.A. | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| Spin-coater | Mikasa Co., Ltd., Japan | MS-A100 | |
| Spininng confocal microscopy | Oxford Instruments | Andor Dragonfly Spinning Disk System | |
| StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U) | Fujifilm wako | 195-16053 | |
| SU-8 3010 | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 3010 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 developer | |
| Tris-EDTA | Nippon Gene | 314-90021 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant | Fujifilm wako | 226-01781 |
References
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