이 양파르트 갈4-UAS 시스템은 Anopheles 감비아에서 기능성 유전 분석을 허용하는 제어된 스파티오 측량 방식으로 유전자 발현을 수정하기 위한 다목적 도구입니다. 이 시스템을 사용하기 위해 설명된 절차는 형광 단백질 마커 및 배아 고정을 위한 pupae의 반 표준화된 복제 전략, 섹스링 및 검열입니다.
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이 논문에서
요약
초록
이중 형 GAL4-UAS 시스템은 기능성 유전 분석을위한 다재다능하고 강력한 도구입니다. 시스템의 본질은 조직 특정 방식으로 효모 전사 인자 GAL4를 표현하는 형질전환 '드라이버' 라인을 교차하는 것으로, GAL4를 결합하는 업스트림 활성화 서열(UAS)에 의해 발현이 조절되는 후보 유전자/RNA 간섭 구조를 운반하는 형질형 '응답자' 라인을 갖는다. 이어지는 자손에서, 유전자 또는 침묵 구조는 이렇게 규정된 현면 방식으로 발현되어 결과 표현형을 분석하고 유전자 기능을 유추할 수 있게 한다. 이 바이너리 시스템은 심한 피트니스 비용이 유도되더라도 여러 조직 별 패턴에서 트랜스진 발현에 의해 생성된 표현형을 선별하는 실험적 접근법의 유연성을 가능하게 한다. 우리는 Anopheles 감비아에 대 한이 시스템을 적응, 아프리카에 있는 주요 말라리아 벡터.
이 문서에서는 GAL4-UAS 분석 중에 사용되는 몇 가지 일반적인 절차를 제공합니다. 우리는 이미 생성 된 An. 감비아 GAL4-UAS 라인뿐만 아니라 업 규제 및 RNAi 노크다운을위한 새로운 응답자 구조의 복제를 설명합니다. 우리는 유전 십자가를 확립하기 위하여 모기 강아지의 성화를 위한 단계별 가이드를 지정합니다, 또한 드라이버와 응답자 삽입을 태그하는 형광 유전자 마커의 상속을 따르는 검열 자성을 포함합니다. 우리는 또한 배아 발달을 연구하기 위하여 An. 감비아 어 태아를 지우기 위한 프로토콜을 제시합니다. 마지막으로, 대상 유전자의 GAL4 다운스트림의 CRISPR/Cas9 삽입을 통해 드라이버 라인을 생성하는 방법의 잠재적 인 적응을 소개합니다.
서론
이 양파르트-UAS 시스템은 곤충 모델 유기체 Drosophila melanogaster1,2,3에서 유전자의 기능적 특성화의 주력이다. GAL4-UAS 시스템을 사용하기 위해, 변성 드라이버 라인은, 규제 서열의 통제하에 효모 전사 인자 GAL4를 표현하고, GAL4에 의해 인식되는 업스트림 활성화 서열(UAS)에 의해 제어되는 관심 또는 RNA 간섭(RNAi) 구조의 유전자를 운반하는 응답자 라인과 교차된다. 본 십자가의 자손은 GAL4 발현을 제어하는 프로모터에 의해 지시된 현면 패턴에 대한 관심의 변형을 표현한다(도 1). 운전자-응답자 십자가의 자손에 의해 표시되는 표현형은 후보 유전자의 기능을 해명하기 위하여 평가될 수 있다. D. 멜라노가스터는 다른 유기체로부터 유전자를 검사하는 데 사용되었지만4,5,6,7, GAL4-UAS 시스템은 이제 관심있는 종
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프로토콜
1. UAS 구조물의 설계 및 시공
- 후보 유전자 발현을 위한 벡터의 설계 및 조립
- 후보 유전자 업 규제에 사용할 서열을 결정한다.
- 관심 있는 변형으로부터 cDNA/gDNA를 시퀀싱하고 게시된 서열과 비교하여 신원을 확인하고 진단 다이제스트를 위한 잠재적인 SMP 및 제한 부위를 식별합니다.
- 유전자 증폭에 사용되는 전방 프라이머가 네이티브 Kozak 서열을 커버하고 적절한 경우 코돈을 시작하도록 하십시오. 시작 코돈의 상류에 ~ 10 bp 바인딩 프라이머는 코작 시퀀스를 포함합니다.
- 대부분의 상황에서 역 프라이머로부터 증폭된 단편에 스톱 코든을 포함합니다. 설명된 플라스미드 벡터에 제공된 3' 종단 서열을 사용하거나, 후보 유전자 게놈 서열로부터 증폭한다.
- 원하는 경우 특정 코돈 바이어스로 상업용 시퀀스를 주문하십시오.
- 표준 서브클론 절차를 사용하여 UAS 플라스미드 벡터에 유전자 카세트를 삽입합니다(예: pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP]15(그림 1
- 후보 유전자 업 규제에 사용할 서열을 결정한다.
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결과
eYFP, dsRed 및 eCFP의 3xP3 발현은 안감비아푸에의 눈과 복부 신경리아에서 발현을 생성하는 마커 유전자를 소유한 개인의 신뢰할 수 있고 쉽게 구별할 수 있는 식별을 제공한다(도 3). 성별에 사용되는 남성 및 여성 외성 생식기에서 관찰되는 차동 형태와 식별할 수 없는 pupae의 예는 도 4에서 강조된다. 항문 패들이 생식기의 시각화를 모호하게함에 따라 pupae에서 모든 물을 제거하면 섹스링 어려움이 증가합니다(그림 4D, E). 이 양파르트 갈4-UAS 시스템은 유비쿼터스(도 6A, C) 및 이노세포 동인(도 6B,D) 라인을.......
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토론
모기 유전자 기능을 이해하는 것은 Anopheles를 통제하고 말라리아 전송에 영향을 미치기 위하여 새로운 접근을 개발하는 것이 중요합니다. 설명된 GAL4-UAS 시스템은 후보 유전자의 기능적 분석을 위한 다재다능하고 강력한 시스템으로 현재까지 우리는 살충제 저항17 및 큐티큘러 탄화수소 생산의 유전적 기초를 검사하고, 형광태그상이다른 모기세포 집단8 . 지금까지 응답자 구조는 제한 효소 복제를 통해 플라스미드로 복제하여 UAS의 여러 복제 부위를 하류로 운반하였다(그림 1, 표 1). 그러나 여러 요소(attB 사이트, 3xP3-YFP 및 집시 절연체 시퀀스)를 운반하는 구체의 모듈식 특성으로 인해 새로운 응답자 플라스미드.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 감사로 LSTM과 IVCC (아드리아나 아돌피), BBSRC (새로운 조사자 상 (AL), MRC (BCP에 박사 학생 교직 박사 학생: MR / P016197/1), 웰컴 (경 헨리 웰컴 박사 후 박사 과정 펠로우십 LG: 215894/ Z/ 19/Z) 그 제안에 Gal4UAS 분석을 통합했습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 100 x 15 mm 플라스틱 페트리 디쉬 | SLS | 2175546 | 10개 팩 |
| 1000 &마이크로; L Gilson 피펫 | Gilson | F144059P | |
| 20/25 mL 범용 튜브 | Starlab | E1412-3020 | 400 팩 |
| 3 mL 파스퇴르 피펫 | SLS | G612398 | Greiner 파스퇴르 피펫 3 mL 멸균 개별 포장 |
| 50 mL 팔콘 튜브 | Fisher Scientific | 11512303 | |
| 앱솔루트 에탄올 | Fisher Scientific | BP2818-500 | 500 mL |
| 아세트산 | SLS | 45726-1L-F | 1 L |
| 케이지 | SLS | E6099 | 30x30x30 스크린 포트 |
| 미세 페인트 브러쉬 | 아마존 | UKDPB66 | KOLAMOON 9 개 디테일 페인팅 브러쉬 세트 미니어처 브러쉬 수채화, 아크릴 페인팅, 유화 (와인 레드) |
| 생선 식품 | 아마존 | Tetra Min Fish Food, 모든 열대어를 위한 건강, 색상, 활력을 위한 완전한 음식, 10 L | |
| 포름알데히드 솔루션 | 시그마 알드리치 | F8775 | |
| 마우스 아스피레이터 | 존 호크 | 612 | |
| 연못 소금 | 아마존 | 블래그던 가디언 연못 토닉 소금, 물고기 건강, 수질, 일반 토닉, pH 버퍼, 9.08 kg, 9,092 L 를 처리; | |
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| 차아염소산나트륨 | 피셔 사이언티픽 | S25552 |
참고문헌
- Brand, A. H., Perimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Duffy, J. B. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife.<....
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재인쇄 및 허가
